油菜脂肪酶基因克隆及表达的研究

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1、j劳震逢戈．挚博士学位论文油菜脂肪酶基因的克隆及表达研究摘要脂肪酶是一个超级基因家族，广泛存在于动植物和微生物中。脂肪酶主要分为两类，即GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶。已有的研究表明，GDSL脂肪酶具有脂水解活性，在食品、香料、化妆品等行业中具有潜(j在的应用价值。而且，植物中GDSL脂肪酶可能在调控植物生长和发育中扮演重要角色。油菜是十字花科油料作物，与拟南芥具有较近的亲缘关系，已经成为研究植物油脂代谢的重要材料，因此研究油菜中GDSL脂肪酶在油脂代谢过程中的作用将有助于揭示其与植物生长发育的

2、关系，同时也为油菜脂肪酶的应用打下理论基础。本研究通过对拟南芥GDSL脂肪酶基因及其蛋白编码序列的生物信‘息学分析、油菜GDSL脂肪酶基因全长cDNA序列的克隆和表达，以及对BnLIPl基因进行原核表达等研究，得出以下结果：1)对拟南芥GDSL脂肪酶基因及其编码的氨基酸序列的生物信息学特征进行了系统的分析。基于生物信息学数据库的资源，获得了99个拟南芥GDSL脂肪酶基因，对应107个非冗余cDNA序列。研究结果显示，它们的基因结构复杂，分别含有1～13个内含子，而且内含子大小从。几十bp到lkb不

3、等。这些基因在拟南芥染色体(ChromosomesI～V)上呈j澎芡通文学博士学位论文无规律分布，有的GDSL脂肪酶基因在染色体的某些区域如染色体I的短臂近着丝点区域、长臂中部及近端粒区域集中分布，也有的基因在染色体上呈串联分布。序列同源性比对发现，编码不同GDSL脂肪酶蛋白的氨基酸序列具有相对保守的区域，但是序列之间的同源性并不高。在进化关系上，拟南芥GDSL脂肪酶分为三组(GroupsI—III)，分别由28、40和39个成员组成。通过结构域分析发现，拟南芥中大部分GDSL脂肪酶具有典型的GD

4、SL脂肪酶的特征，即它们的GDSL脂肪酶结构域，、(PF00657)靠近N．端，前面的氨基酸序列可能作为信号肽介导蛋白的分泌。但是，个别GDSL脂肪酶的GDSL结构域在N一端或位于蛋白序列的中部，而有的氨基酸序列中同时具有多个GDSL脂肪酶的结构域。亚细胞定位预测分析结果显示，有99个脂肪酶的N．端含有长度为6-113个氨基酸的信号肽，它们可能负责介导蛋白定位到内质网，然后分泌到细胞的其它部位甚至胞外。另有2个GDSL脂肪酶蛋白(Acc．Nos．INP195980，NP173441)很可能分别定位

5、到线粒体和叶绿体，4个蛋白(Acc．Nos．NP_199404，NP_201098，NP_199004，NP_196001)中没有明确的亚细胞定位信号。由此可见，拟南芥GDSL脂肪酶的确是一个大家族，各成员在序列、基因结构、结构域的位置、亚细胞定位特征等方面都具有不同程度的多样性。拟南芥的大部分GDSL脂肪酶基因结构复杂，序列同源性不高，GDSL脂肪酶结构域靠近N．端，而且具有分泌信号。基于目前的研究报道，这些GDSL脂肪酶很可能在拟南芥的种子萌发。IIj肇芡鱼戈学博士学位论文，(GroupIII

6、)、花发育及抗逆反应(GroupII)等过程中发挥重要作用。2)从油菜种子萌发的黄化幼苗中克隆了BnLIPl全长cDNAfGenBankAcc．No．AY870270)，其大小为1318bp，推导该序列编码一个含389个氨基酸残基、分子量为43．32kDa的蛋(Acc．No．AAX58135)。BnLIPl基因序列与拟南芥GDSL脂肪酶基因序列具有较高的同源性，其中与Arab．j的同源性达70％；而在氨基酸水平上BnLIPl蛋白与Arab．1。的同源性达820／6。通过氨基酸序列的多重比对发现，B

7、nLIPl的氨基酸序列与部分已报道的植物GDSL脂肪酶具有多个保守的区域，其中含有丝氨酸活性位点的GDSL．motif靠近蛋白的N-端，该motif中玎e．42取代了Leu；同时推测Ser．41、Asp一180(或Asp-345)、His一348三者组成具有催化活性的三联体。由此可见，所获得的cDNA编码的蛋白具有GDSL脂肪酶的一级结构特征，而且该蛋白具有GDSL脂肪酶结构域，因此推测BnLIPl是GDSL脂肪酶家族的成员。预测发现，BnLIPl蛋白具有4C个N．糖基化位点，其在进化上与拟南芥G

8、roupIII的成员尤其是Arab．1的亲缘关系最近，属于GroupIII蛋白家族。此外，还克隆了该基因的基因组序列(GenBankAcc．No．AY871275)，该序列长度为1601bp，含有4个内含子，与拟南芥中的大多数GDSL脂肪酶基因类似，其基因结构比较复杂。同时，Southern杂交分析表明其很可能以多拷贝的形式存在于油菜基因组中。。组织器官表达分析结果表明，BnLIPl基因在油菜休眠种子以及萌发III≯矛芡鱼名学博士学位论文后3天之前的材料中不表达，而从萌发后第3天开