肿瘤研究方法-approaches and techniques

《肿瘤研究方法-approaches and techniques》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、ApproachesandTechniquesinResearchonTumorAcourseforPh.D.candidates肿瘤的实验动物和细胞研究技术Theanimalmodelandinvitroresearchoftumor常用研究方式：InVitro:体外研究，细胞、组织培养下进行InVivo:体内研究，人类疾病的动物模型ExVivo:细胞经体外实验处理后，再回输到体内体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等体外研究(InVitro)原代培养肿瘤细胞:从肿瘤组织中分离得到的细

2、胞在体外成功地进行培养称为原代培养(primaryculture)肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约7～10天传代一次）半年以上,生长稳定,并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系(cellline)肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cellstrain),细胞具有相同的基因型和表型(单克隆)肿瘤细胞株的建立：1、直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养建系和建株;(从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织

3、分离培养建系及建株;(从移植瘤)3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正常的人或动物的细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化)肿瘤细胞株的鉴定：1.有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等2.形态学观察:▲普通倒置相差光镜:活细胞的形态,细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长,▲Giemsa染色或H.E.染色的光镜形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:HeLa:高浓度血清→长梭形;低浓度血清→圆形细胞,排列如鹅卵石路面;▲透射和扫描电镜▲3

4、D组织结构3.核型及染色体观察:整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析,相隔一定时间重复观察数次4.生长特性:分裂指数（[3H]-thymidine或5-BrdU的labelingindex）、生长曲线、细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（platingefficiency）半固体培养介质中的集落形成率5.组织特性的鉴定:免疫细胞化学方法上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（EMA）、癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原标志:人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上,T淋巴细胞:UCHL-1(

5、CD45RO),B淋巴细胞:L26（CD20）,软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm）肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白神经源性：神经微丝（NF）、S-100蛋白、Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性：α-1抗胰蛋白酶、α-1抗糜蛋白酶、CD68血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL)基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;6.

6、其他特性：(a)分泌激素和异位激素:绒毛膜癌→HCG垂体瘤→生长激素肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌→ACTH人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）→促性腺激素肝癌→HCG(b)   肿瘤细胞的受体表达:ERPRAR(c)   酶及同工酶活性:酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基转移酶)、变化诱导剂糖皮质激素、多肽激素改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺→脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶活性增7倍左右特异的同工酶谱：绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶(d)   癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高转移人卵巢细胞系HO-891

7、0PM表达：p53p16bcl-2nm-23CD44v6c-erbB-2EGFR等基因的蛋白产物不表达：Bax基因的蛋白产物7.细胞株交叉污染的检测：细胞遗传学方法：染色体分析特异的染色体标志探针作FISHG带核型分析鉴别同种肿瘤细胞Q带分析检测人Y染色体免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定生化方法：同工酶谱或其它生化指标8.微生物污染的检测：细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子病毒：病毒核酸和蛋白产物支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-s

8、tain(Hoechst33258，即二苯并咪唑染色)较为常用,356nm光的激发下可发出458nm的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标)（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）▲核型分析出现非整倍体▲能在软琼脂培养基中增殖并形成集落▲异种动物接种能生成肿瘤▲端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高指标正常细胞转化的纤维母细胞转化的上皮细胞形态伸展良好,折光较弱;核质比小,梭形,伸展较差,折光较强;核质比大,与正