幽门螺杆菌cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

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1、幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备：韩军，邵世和，谢立苹，黄世腾，田树伟，黄河【摘要】目的：构建幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)Cag致病岛(Cagpathogenicityisland，CagPAI)编码的hp0540基因的原核表达系统，并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段，克隆至pMD182T载体后，进行序列测定，并对其序列进行生物信息学分析;构建pET28ahp0540原核表达载体，转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE法鉴定目的蛋白

2、的表达，并以Ni2+NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因，全长1086bp，编码361个氨基酸，与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDSPAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量约为39000，经Ni2+NTA柱纯化后可获得重组蛋白，重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体，为研究该基因的功能奠定了基础。【关键词】幽门螺杆菌;Cag致病岛;CagI;多克隆抗体　　[Abstract]Ob

3、jective:Toconstructtheexpressionsystemofhp0540fromstrainNCTC11637ofHelicobacterpylori(Hp)andpreparethepolyclonalantibodyserumofCagI.Methods:Thehp0540geneplifiedbyPCRicDNAofHpNCTC11637astemplate.TheplasmidpMD182Thp0540ethodandsequenced.Thesequenceofhp0540aticsapproach.TheexpressionvectorpET28ahp0

4、540edintoE.coliBL21DE3bymolecularcloningmethod.TheproteinethodafterinducedbyIPTG.ThetargetproteinCagImunizerabbittopreparepolyclonalantibodyserum.Results:Thehp0540hasbeenclonedsuccessfully.Thesequenceanalysisforhp0540shoologyolecularmassofthepurifiedproteinandpreparedthepolyclonalantibodyserumsucces

5、sfully,，TFSS)，通过该系统细菌可以把一些诸如细胞毒素抗原(CagA)、空泡毒素A(VacA)、肽聚糖等致病因子注入宿主细胞，并进而引起细胞在增殖、骨架重排、细胞连接、形态延伸与散射等方面的改变[4]。hp0540是CagPAI内的第19号基因，与根癌农杆菌的TiDNA转运系统中的基因不具有同源性，由hp0540编码的CagI蛋白是TFSS的一伴侣样蛋白。有研究表明CagI蛋白可以与新近发现的宿主整合素受体β1发生相互作用，从而影响毒力因子CagA的转运，但其具体的作用机制及完整的功能尚不清楚[5]。因此，本文通过对CagPAI中的hp0540基因进行克隆表达及其多克隆抗体的制

6、备，将为进一步研究该基因在Hp致病机制中的作用奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌株HpNCTC11637购自中国预防科学院流行病学研究所,大肠埃希菌DH5α及BL21DE3为江苏大学医学技术学院中心实验室保存。　　1.1.2主要试剂和仪器哥伦比亚培养基、厌氧袋购自OXOID公司;ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ，T4DNA连接酶(快速连接试剂盒)、IPTG、2000bp、15000bpDNA标准参照物及蛋白质分子量标准(低)均购自TaKaRa公司;10kbDNA标准参照物购自TOYOBO;Ni2+NTA购自Qiagen公司;pET

7、28a载体由江苏大学医学技术学院中心实验室保存;PCR基因扩增仪(MastercyclerGracent，Eppendor公司)、自动凝胶成像系统(美国UVP公司)，其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》配制。　　1.2方法　　1.2.1Hp的培养与鉴定及基因组DNA提取HpNCTC11637标准菌株按常规微需氧方法进行培养与鉴定。DNA用常规酚、氯仿抽提法获得，-20℃保存备用。　　1.2.2hp