幽门螺杆菌cag致病岛中hp0523基因功能鉴定和分析

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1、江苏大学硕士学位论文摘要幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hpylori)的细胞毒性蛋白A(CagA)是一个重要的毒力因子，与胃癌的发生密切相关。其是通过Cag致病岛(cagpathogenicityisland，Cag—PAl)编码的Ⅳ型样分泌装置，转运进入胃上皮细胞，发挥毒性作用。而Cag．PAl中编码的基因功能及其致病机理均尚未十分明确。鉴此，本文初步研究了Cag-PAl中编码的hp0523基因的功能，并初步探讨其在CagA转运过程中的作用，旨在为深入研究Cag．PAl的致病机理奠定基础。方法：1．利用PCR技术从且py／or／基因组DNA中扩增获取hp0523基因，P

2、A克隆后构建pGEM．T-hp0523，进行序列测定；并对其序列进行生物信息学分析研究；2．构建pET-28a．hp0523原核表达载体，转化表达宿主菌BL21(DE3)；经IFFG诱导后，SDS．PAGE法和Westernblot法鉴定表达后，并以Ni2+-NTA柱分离纯化目的蛋白；进一步对纯化蛋白进行生物学活性研究；3．扩增获得hp0523基因上下游同源臂片段F1、F2，构建自杀质粒pBlueKM40／Ahp0523：：Km。，电击转化且pylori后经抗生素筛选hp0523基因缺失株，再进行PCR鉴定；4．采用hp0523基因缺失株和野生株与胃癌上皮细胞BGC．823进行共培养，而后采

3、用Westernblot法检测CagA蛋白转运能力变化。结果：1．扩增获得的hp0523基因全长为510bp，编码169aa，与GenBank公布的26695、J99同源性为92---95％：蛋白相对分子量Mr预测为19．7kDa，等电点∥为9．53；蛋白二级结构分析，在33"165位aa之间存在一个保守的SLT催化基序，第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位点，C端序列上含有一个肽聚糖结合域“AVGAY”，故预测hp0523基因可能是一个肽聚糖水解酶编码基因；2．构建获得了原核表达载体pET-28a．hp0523，IPTG诱导后，经SDS．PAGE鉴定和Westernblot鉴定有

4、目的蛋白表达；采用Ni2+-NTA柱梯度洗脱后，分离获得了目的蛋白HP0523；江苏大学硕士学位论文3．HP0523经复性处理后，采用溶菌斑点实验证实其具有溶菌活力：而后采用SDS煮沸法分离提取获得细菌肽聚糖，进行凝胶酶谱分析后，发现HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明，HP0523具有广谱的溶菌能力，但酶活力较溶菌酶低；其最适酶活力pH值为6．0；4．连接F1、F2后构建自杀质粒pBlueKM40／Ahp0523：：Km。，电击转化后经抗生素筛选，并经PCR验证后获得了hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分别与胃癌上皮细胞BGC．823进行共培养后，发现hp0523基因缺

5、失株处理组，胃癌上皮细胞内未能检测到CagA的转运。结论：本研究认为hp0523基因是一个肽聚糖水解酶的编码基因，且其参与CagA的转运，可能是Cag．PAIIV型样分泌装置的组成成分之一。关键词：幽门螺杆菌，Cag致病岛，IV型样分泌装置，肽聚糖水解酶Ⅱ江苏大学硕士学位论文ABSTRACTCytotoxin—associatedgeneA(CagA)isthemostimportantvirulencefactorinHelicobacterpylori(HpylorO，whichinvolvedinthedevelopmentofgastriccarcinomainhuman．Itwas

6、translocatedintothehumangastriccellviaatypeIV-likesecretionapparatusthatencodedbytheCagpathogenidqisland(Cag—PAt)inH．py／or／．However,thefunctionofgenesandthemechanismofpathogenicityinCag·PAIarenotdear．Therefore，wefocusedontheidentificationandcharacterizationofthehp0523genefromCag—PAlinthisstudy．More

7、over,weexploredtheroleofhp0523intheprocessofCagA'stranslocation．AlloftheseresultswillshedlightonthemechanismofpathogenicityinCag—PAl．Methods：1．Thehp0523geneWasamplifiedfromtheH．pylorigenomicDNAviaaPCRmethod