水稻组织培养

《水稻组织培养》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、水稻组织培养实验原理植物组织培养主要利用了植物细胞的全能性，细胞全能性(totipotency)就是指每个生活的细胞中都包含有产生一个完整机体的全套基因，在适宜的条件下，细胞具有形成一个新的个体的潜在能力。材料选取水稻种子(干种子或是湿种子均可)作为植物组织培养的外植体仪器电子天平、酸度计、微量移液器、电炉、培养瓶、培养皿、烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻璃棒、试剂瓶、超净工作台、剪刀、镊子、照度计、摇床、灭菌锅培养基母液配置大量元素母液配制:①母液A1(浓缩10倍):称取KNO319g、NH4NO316.5g、MgSO4·7H2O3.7g、KH2PO41.7g，分别溶

2、解后混合并定容至1000ml，4℃保存备用;②母液A2（浓缩10倍）：称取CaCl2·2H2O4.4g定容至1000ml，4℃保存备用。微量元素母液配制(母液B，浓缩100倍)称取MnSO4·4H2O2.23g、ZnSO4·7H2O860mg、H3BO3620mg、KI83mg、NaMO4·2H2O25mg、CuSO4·5H2O2.5mg、CoCl·6H2O2.5mg，分别溶解并混合后定容至1000ml，4℃保存备用。铁盐母液配制(母液C浓缩100倍):称取Na2-EDTA3.77g、FeSO4•7H2O2.78g、分别溶解并混合后定容至1000ml，4℃保存备用。有

3、机物质母液配制(母液D，浓缩50倍):称取甘氨酸100mg、盐酸硫胺素20mg、盐酸吡哆素25mg、烟酸E25mg、肌醇5000mg，分别溶解后混合并定容至500ml，4℃保存备用。生长调节物质母液配制:为了操作方便，生长调节剂也可先配制成母液(药品在配制时若不溶于水，可用少量溶剂先溶解，如萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3），2,4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95％酒精溶解，然后加水，若溶解不完全再加热;激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的HCL中，叶酸需用少量稀氨水溶解称取50mg生长调节物质，溶解后，蒸馏水定容

4、至100ml，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，4℃保存备用。MS固体培养基的配制及灭菌取1000ml烧杯一只，加500ml水，然后加琼脂10g，放至电炉子上(铺有石棉网)加热，边加热边搅拌至琼脂完全溶解(然后加蔗糖或白糖)30g搅拌至其溶解;分别称取母液A1100ml、母液A2100ml、母液B10ml、母液C10ml、母液D10ml，到此烧杯中，搅拌均匀后用0.5mol/LHCL或0.5mol/L的NaOH将培养基PH调至5-8左右。不同培养阶段所需要的生长调节物质有很大的不同，因此不同阶段的培养基中要加入的生长调节物质是不一样的，如愈伤组织诱导培养基

5、（MS+2,4-D2.0mg/L）中2,4-D为每升2.0mg，而2,4-D母液的浓度为0.5mg/ml，则配制时要从其母液中吸取4mL。培养基配制好后，将其分装至150mL三角瓶中，每瓶40mL左右。用两层牛皮纸或硫酸纸将装好培养基的瓶口包裹住，用3个乳胶圈将瓶口封紧即可灭菌。培养基的灭菌条件为121℃，25min左右，灭菌时要将无菌操作的所需的备品灭全，包括剪刀、镊子、刀片、无菌水、报纸或滤纸等。外植体的表面消毒及接种选取饱满成熟的水稻种子，手工剥去颖壳，选取干净完整的颖果(在超净工作台内，先用75％酒精处理30s，再用0.1％升汞处理10min或2％次氯酸钠溶液

6、15min，然后用无菌水冲洗5~6次(用灭菌后的无菌滤纸将种子表面的水分吸干，然后用镊子夹取水稻种子轻轻放到愈伤组织诱导的培养基表面，每瓶5粒左右(每接5瓶左右，用75％酒精擦拭手和台面，进行消毒。不同培养阶段的培养基配方及培养条件：愈伤组织诱导和继代培养基为MS+2,4一D2.0mg/L，培养条件为黑暗培养，温度控制在26(±1)℃;愈伤组织分化芽培养基为MS+6一BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，光照强度为3000lux左右，光照时间为14h,温度控制在26(±1)℃;生根培养基为1/2MS+NAA1.0mg/L，光照强度为4000lux左右，光照时间为1

7、4h,温度控制在26(±1)℃。实验结果根据上述培养基配方所建立起来的水稻植株再生体系，愈伤组织诱导率)芽分化率及生根率均较高。水稻种子在诱导培养中培养10天左右，从水稻芽的基部长出淡黄色)呈细小颗粒状的愈伤组织(图A)（水稻种子在诱导培养中所得到的愈伤组织）将愈伤组织转入分化芽的培养基后约7天，开始出现绿点并逐渐增多(图B）（愈伤组织在分化芽的培养基中出现绿点）约5天后，原来出现绿点的愈伤组织整体颜色加深，并有部分芽已向小苗过渡(图C)（由绿点所长成的丛生芽）约10天后，有丛生芽长成的幼苗逐渐增多，已有部分幼苗叶片展开(图D)（由丛生芽长成的绿色幼