卵胞浆内单精子注射后人精子激活鼠卵母细胞能力的研究

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1、卵胞浆内单精子注射后人精子激活鼠卵母细胞能力的研究-->[摘要]目的:研究各种质量精子的鼠卵母细胞激活能力。方法:选用20~25g昆明种雌性白鼠,超排卵取卵细胞,用Percoll密度梯度离心法处理正常精液、少精、弱精、畸精以及冷冻后的正常精液,选择优质的精子进行显微注射,计算卵母细胞激活率、卵细胞形态正常率。结果:各种质量精液中优选的精子激活鼠卵母细胞能力差异无显著性(P>0.05)。结论:人精子激活鼠卵母细胞能力与最初精液状态没有直接的相关性,它不受精子数量、活力、运动性及形态的影响。卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmicinjec-tion,ICSI)技术是目前世界范围内广

2、泛开展的治疗男性不育症的显微受精技术。据报道,ICSI后卵细胞平均受精率为65%~70%,尚有大约1/3的卵子未能受精[1]。研究表明,精子激活卵细胞相关因子(sperm-bornoocyte-activatingfactor,SOAF)对卵细胞的激活作用在ICSI技术中起着关键的作用[2]。本文依据人精子激活鼠卵母细胞理论,在本室建立的人精子注入小鼠卵母细胞模型基础上[3],对各种质量精子激活鼠卵母细胞能力进行研究,为ICSI前对精子能否激活卵母细胞进行筛选技术奠定实验基础。1材料与方法1.1实验动物本校动物中心提供的饲养于人工昼夜周期的昆明种雌性白鼠,体重20~25g,喂以含微量元素标准

3、饲料,自由摄水,分笼饲养。1.2试剂小牛血清、孕马血清(PMSG)、人类绒毛膜促性腺激素(hCG)、M199粉由北京百灵克生物科技有限责任公司提供,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、10Earle′s溶液、透明质酸酶(BoviypeV)、Percoll、Milli-Q水由Sigma公司提供。1.3仪器倒置相差显微镜(MM188),解剖镜和倒置镜(日本Nikon),恒温孵箱TC2323、恒温平台(美国Shel.LAB),显微注射仪、EG-400微型磨针仪、PN-30显拉针仪、MF-900微型锻针仪(日本NARISHGECo.Led.Group)。1.4样品采集和处理雌性小鼠超排卵及采卵法见

4、参文[4]。取出卵细胞后置孵箱中培养2h,用100IU•ml-1透明质酸酶的HBE液处理1min,培养液冲洗2次,置培养箱中培养备用。人精优选和处理:精液标本于本研究室不孕症门诊,患者禁欲3~5d,手淫法无菌取精,液化后,按u;m,针尖斜面为30°,针尖弯度25~35°。固定针内径为15~20μm,外径60μm,针尖斜面30°,针尖弯度25~35°。显微操作准备及操作过程见参文[5]。1.6实验设计与分组按es;106个•ml-1,a级精子>25%或者前向运动精子>50%(a级和b级),形态异常率2结果2.1操作过程对卵母细胞激

5、活能力的影响①实验对照组、空白对照组卵母细胞激活率远远低于实验组(P0.05),其中正常组较其他4组略高,畸型精症组卵细胞激活率最低,结果见表2。卵细胞第二极体的排出在注射后2h左右,提示卵细胞已经被激活。本研究结果中大部分激活卵细胞没有原核形成,可能卵细胞被激活排出极体后,发育停滞。3讨论精子能否激活卵细胞是ICSI技术成功的关键。研究表明,SOAF是启动卵母细胞激活的关键因素。SOAF包含一个或更多精子头膜下的热敏感蛋白质成分和至少一个热稳定的核周基质中成分,它们共同作用激活卵细胞,无种属特异性[2]。资料显示SOAF的不表达能引起ICSI的失败。目前临床上还没有一种直接检测SOAF方法

6、,也没有建立一种检测精子激活卵细胞能力的实验。有人曾用金黄地鼠卵和蛙卵进行研究,但易受操作程序的影响,人卵又不易获得。本研究室依据人精子激活鼠卵母细胞理论[3]已建立了检测人精子激活能力的模型[4]。本研究就是在此模型基础上将各种质量精液的精子注入鼠卵母细胞中,观察卵细胞的激活情况,以检测人精子激活卵母细胞的能力。本实验结果显示,少精、弱精、畸形精症以及冷冻精组精子优选后的卵母细胞激活率与正常组比较均有不同程度的降低,但差异无显著性,说明可能在最初的精液检查中精子的密度、形态及活力对卵母细胞激活率影响不是很大。Percoll较其他方法能够回收更多的形态正常的精子,并明显增加精子的活力和体外生

7、存能力。本研究应用Percoll法对各种质量的精液进行处理,选择优质精子进行ICSI注射,这可能也是各组之间差异无显著性的原因。实验结果显示,少精、弱精、畸形精症以及冷冻精组激活率与正常精液组比较差异无显著性,但有降低趋势,提示精子激活卵母细胞的能力也受到影响,这是否表明精子中存在SOAF缺乏,还有待进一步研究。精子生成基因位于Y染色体长臂,由多个基因位点组成。AZF缺乏或突变能导致精子数目减少或缺乏[6]。