固定化酶的制备及应用研究

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1、第一章绪论1.1酶分析法概述酶是一类由细胞产生的具有催化能力的蛋G质。按照其化学组成的不同，酶有两类：化学组成主耍为蛋白质的酶，化学组成为核糖核酸酶的酶；前者称为蛋白类酶，后者称为核酸类酶。酶作为生物催化剂与非酶催化剂和比，具有较强的专一性、较高的催化效率和温和条件下反应的特点Uj。酶的应用己有几千年的历史，但是人们真正冇0的地利用酶是从19世纪末开始的，至今还不过100多年。特别是近几十年来，随着酶生产的不断发展，酶已经广泛地用于食品、轻工、医药、环保以及科研等领域。目前己经发现的酶约有2200余种，

2、但得以应用的酶不足1/10,而己达到工业化生产和应用的酶不过儿十种。因此，酶的应用大有潜力可挖l2j。酶分析法是生化分析的重要内容，主要包括酶活力测定和酶法分析两种类型。两考检测的对象虽有所不同，但原理基本一致，都是利用酶的专一性、高效性催化反应，通过酶反应速度的测定进行含量分析。酶反应动力学是研宄酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学。底物浓度、温度、酶浓度、pH对反应速度均有影响。在一定的酶浓度下，如将初速度对底物浓度的关系作图，可以发现:开始反应吋底物浓度与反应速度成正比；反应一段时间后，反

3、应速度虽然还在继续升高，但不是以按正比形式；再继续反应，由于酶已被底物所饱和，反应速度不再增加且达到了最大反应值。如阁1.1所示。人们曾提出各种假说来解释上述现象，其中比较合理的解释是“中间产物学说”。按此学说，1913年Michaelis和Menten在前人工作的基础上，提出酶促反应方程图1.1底物浓度对酶催化反应速率的影响酶法分析的分析对象为酶的底物、辅酶、活化剂和抑制剂。在进行这类分析时，先耍根据分析对象选择适宜的“工具酶”，然后通过酶反应进行催化、测定，最后在借助和应的校正曲线来检知其含量。在酶

4、法分析检测的对象中，一般都只能用动力学分析法但底物可以采用总变量分析法。动力学分析法的原理是在酶法分析的反应系统中，如果其他反应条件都处于最适，只有被测对象如底物、辅酶、活化剂或抑制剂的浓度是酶反应屮决定速度的唯一因素时，酶反应速度和这些因素的浓度间就将有一个确定比例关系，测定酶反应的速度就可求知它们的浓度。总变量分析法也称为终点法或平衡法，它是依据被测物质性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行分析，然后在反应完成后，再借助物理、化学方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，最后计算出被测物的实际含量或浓

5、度的一种分析方法。此法应用时应考虑工具酶用量与反应平衡点两个问题且其仅能用于底物的测定［4］。如何实现酶的高效率及特异性是待解决的重要问题，酶的结构和光谱研宄提供了比较完善的酶分析并使我们更进一步理解酶动力学。随着科技的发展，数据收集和分析己经运用到解决这些复杂的问题上Hammes等对核糖核酸酶，天门冬氨酸转氨酶，特别是二氢叶酸还原酶进行研究，认为构象变化是几乎所有的酶机制的重耍组成部分［61。Leong等讨论了在脉冲电场对酶动力学和胡萝卜中内源性抗坏血酸氧化酶的热稳定性的影响。电场强度为0.2-1.2

6、kV/cm，脉冲电能为l-520kJ/kg下，酶动力学和内源性抗坏血酸氧化酶的失活(55-70°C)由米氏模型和反应模型展示出来l7j。Dong等研究了酶的催化过程。酶是把丰富的化学生物转化为维持生命的生物大分子的催化剂，己经发现多个构象和许多平行的路径参与酶催化过程，并设计了人工酶，它模拟了天然酶的催化功能及其结构的复杂性，使得人们对酶催化过程有更进一步的认识和理解［8］。Shekhovtsova等应用酶分析法测定食品中抗坏血酸的含量，这个反应速率可用分光光度计测量诱导期的持续时间绘制动力学曲线

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8、。Chen等通过几种分析方法的比较来测定抑制剂对血管紧张素I转换酶的影响。用具冇较好的线性、精确度及重复性的可见分光光度法(VSP)和高性能的液相色谱(HPLC)方法用于测定血管紧张素I转换酶(ACE)的抑制活性并对这两种测试方法进行比较。通过一系列的实验，显示HPLC具有较高灵敏度和精度，适合于测定ACE抑制活性抗高血压肽敏感缩氨酸。而由于VSP可以同时测量多个样品且操作简单，适合分析抑制ACE活性的物质U0j。脲酶分解微生物的中的尿素产生氨，脲酶已经广泛用于各种领域，如农、Ik,食品生产，医药，生物

9、矿化过程和分析［1M4］。Okyay等研究了一种新型的高通量比色法来分析脲酶活力。该方法显著降低了测试时间。且该方法快速，灵敏。简便，性价比高，并不使用任何有毒的化学试剂⑽。Olech等研究了蒜、葱和甘蓝等植物汁液中硫代亚磺酸脂的浓度对刀豆脲酶活性的抑制影响并对动力学的抑制机制进行丫研宄［16］。醇脱氢酶是可以可逆催化醇脱氢形成醛或酮的酶，除酵母外，它也广泛存在于高等植物、动物肝脏、细菌等生物界。被广泛应用了食品、医药、酿酒等工业117_2