登革2型病毒ngc株e基因部分序列原核蛋白表达

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　　登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达【摘要】　　目的：构建登革2型病毒NGC株E基因区1~476bp的原核表达载体并进行原核表达。方法：将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+)，命名为pET28a(+)-En；经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21（DE3）菌株，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、ethods：GeneEpartialsequenceofdenguevirustype2strainNGCplifiedbyRT-PCR,insertedintoprokaryoticvectorpET28a(+),andtransformedE.coliBL21cells.Thegenepartialsequenceolecularonoantibodyagainstdenguevirustype2.CytotoxicexperimentsinvitrosuggestedthattheproteinhadrelativelycytotoxicitytoC6/36,andtheTCID50l.Conclusion：pET28a(+)-EbcontaininggeneEpartialsequencecanbehighlyexpressedinBL21.Theantigenicityoftheproducedproteinsprovideapotentialsourceofreagentfordenguevirusdiagnosis；TheexpressedproteinshavesomecytotoxicitytoC6/36.　　［Keyorrhagic Fever，DHF）和登革休克综合症（DengueShockSyndrome，DSS）。E蛋白是DEN的包膜蛋白,存在抗体依赖的增强感染作用表位和免疫保护表位。E蛋白全长约500个氨基酸,N端80%的氨基酸组成膜外区,C端20%的氨基酸构成跨膜疏水区[1]。E蛋白可分为3个结构区(DⅠ、DⅡ、DⅢ),类似于以前定义的抗原区(C、A和B)[2]。近年来，有学者曾用多种表达系统来表达E蛋白,用于E蛋白结构与功能的研究及基因工程疫苗的研制[3]，但未曾有学者对A区进行表达。本课题将DENNGC株E基因A区部分序列分别克隆入原核表达载体，经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21（DE3）菌株，用IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE、109、BL21(DE3)购自北京天为时代科技有限公司。pET28a(+)购自上海捷瑞生物工程有限公司。IPTG、EcoRⅠ、XhoⅠ、Amp、Kan、T4DNA连接酶，购自大连宝生物工程有限公司。HIS-BindPurificationKit、BugBusterTM蛋白抽提试剂购自Novagen公司。鼠抗登革病毒2型单克隆抗体（McAb），由中山大学医学院微生物学教研室郭辉玉、江丽芳教授惠赠。羊抗鼠IgG抗体-HRP购于深圳晶美生物制品有限公司，NC膜,购自华美生物工程公司。　　1.2方法　　1.2.1目的基因的合成　　根据Genbank对DEN-2 NGC株E基因区部分序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成NGC株E基因区部分序列的长度为492bp的基因片段（加两端的酶切位点），两端含有EcoR1和Xho1酶切位点。　　1.2.2原核表达载体pET28a(+)构建及鉴定　　用内切酶EcoR1和Xho1分别双酶切目的基因和质粒pET28a(+)，PCR纯化试剂盒回收目的基因片段和载体片段，T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coliBL21感受态细胞后,涂布于含Kana(浓度100mg/L)的LB固体培养基上,随机挑取单克隆接种于相应的液体培养基中,提取质粒,进行双酶切及PCR鉴定,并送上海捷瑞生物工程有限公司测序。　　1.2.3重组克隆的诱导表达及表达蛋白检测　　用LB培养基培养已鉴定的重组菌，180~200r/min,37℃培养至A600约为0.5时，加IPTG(终浓度为1mmol/L)37℃继续诱导。分别于1、3、6、9h各收集1ml菌液，离心回收沉淀加50μl1×SDS-PAGE上样缓冲液重悬，100℃煮沸5min,12000r/min离心1min,取上清液进行12%的SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色，检测重组蛋白的表达。　　1.2.4重组蛋白的纯化　　应用镍-螯合物琼脂糖树脂柱纯化诱导的重组蛋白，按试剂盒说明书操作。 　　1.2.5表达产物与登革病毒多克隆抗体的免疫印迹反应　　将表达的重组蛋白行SDS-PAGE后，转移到NC膜，分别与第一抗体（DEN1-4鼠特异单抗）和第二抗体（羊抗鼠HRP-IgG）反应，并用DAB显色液显色。　　1.2.6原核表达蛋白TCID50的滴定　　用D-MEM维持液将表达蛋白作10-1到10-8的10倍稀释，分别加入96孔细胞培养板的1日龄C6/36单层细胞，100μl/孔，每个稀释度3个复孔，设细胞和病毒对照，于37℃吸附2h，弃液，加维持液，5%CO228℃培养，每日观察细胞病变（CPE），观察5d，与正常细胞对照无明显退变，病毒对照孔出现明显CPE为判断终点，计算TCID50。　　2.3表达蛋白的检测经SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色观察，含重组质粒的诱导菌在分子量约为23kD处出现1条蛋白条带，经纯化在相应位置也出现条带，重组蛋白的大小与理论预测值一致。从蛋白带型来看，诱导3h的重组蛋白表达量最高（图3），而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的条带较弱。　　2.4表达产物的抗原性分析].1版.北京：科学出版社，2002：190-192. 　　[8]Li-JuanGu,J.hemolymphofImmunizedlarvaeofhousefly,muscadomestica[J].JournalofLifeScience,2006(2):1-9.　　[9]张勇,吴建伟,顾莉娟.凝胶层析法分离家蝇幼虫血淋巴中抗真菌肽的研究[J].中国媒介生物学及控制杂志,2007(3)：200-204.　　[10]郭海萍,林媛，莫秀英，等.家蝇免疫血淋巴的抑菌作用及其免疫活性的研究[J].热带医学杂志,2006(4)：385-387.　　[11]齐静姣,曲传智.不同诱导源诱导家蝇抗菌物质的动力学研究[J].中国人兽共患病杂志,2004(6)：554-555.