《机油降解菌的分离、鉴定及高效降解菌降解特性的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：Ｑ９３９．９单位代码：１０７２０：１５０７１００５０２密级：公开学号ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．硕士学位论文机油降解菌的分离、鉴定及高效降解菌降解特性的初步研究Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ－ｒｅｍｎａｒｏｉｌｄｅｒａｄｉｎｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｌｉｉｇｇｐｙｓｔｕｄｏｎｔｈｅｄｅｒａｄａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｙｇｈｉｈｌｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｒａｄａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｇｙｇ论文作者：黄曼曼指导教师、职称：邓百万教授学科、专业名称：微生物学研究方向：微生物资源保育及开发利用二〇一八年五月 分类号：Q939.9单位代码：10720密级：公开学号：1507100502硕士学位论文机油降解菌的分离、鉴定及高效降解菌降解特性的初步研究Isolationandidentificationofoil-degradingbacteriaandpreliminarystudyonthedegradationcharacteristicsofhighlyefficientdegradationbacteria论文作者：黄曼曼指导教师、职称：邓百万教授学科、专业名称：微生物学研究方向：微生物资源保育及开发利用二〇一八年五月 摘要近年来，随着石油开采及石油工业的发展，石油污染问题日趋严重，而机油作为石油非常重要的一个馏分，在机械制造、维修等行业被广泛应用，产生的大量含油废水不仅污染环境，同时也给人类及其他生物带来很大的危害。分离、驯化高效机油降解菌成为机油污染环境生物修复的一个重要研究方向。本研究通过采集长期受各种机油类物质污染的汉中某工具厂污水处理车间内部活性污泥，利用初筛和复筛的实验方法，筛选出多株机油高效降解菌株，并对机油高效降解菌株进行了降解特性的研究。具体研究结果如下：（1）从机油污染环境中经分离、筛选得到36株可降解机油的菌种，分别为JZ2~JZ4，JZ6~JZ15，JZ17~JZ18，JZ21~JZ24，JZ26~JZ28，JZ30，JZ32，JZ34，JZ36~JZ37，JZ39，JZ41，JZ43~JZ45，JZ47~JZ49，JZ50。从菌落形态学观察、菌体形态观察、革兰氏染色、生理生化测试以及16SrRNA序列分析等方法，对所得的36株机油降解菌株进行鉴定，鉴定结果36株机油降解菌株属于Dyadobacter、Massilia、Arthrobacter（节细菌属）、Acidovorax（食酸菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Ochrobactrum（苍白杆菌属）、Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）、Perlucidibaca、Rhodobacter（红杆菌属）、Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）、Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）、Paracoccus（副球菌属）、Catellibacterium和Shinellazoogloeoides各菌属。（2）利用紫外分光光度法测定初步筛选出的36株机油降解菌的机油降解率，筛选出了JZ6，JZ18，JZ41和JZ50四株高效机油降解菌，在培养温度为30℃，含终浓度为机油1g/L的原油培养基中培养7d后，4株菌株JZ6，JZ18，JZ41和JZ50的机油降解率分别为42.16%，33.94%，33.75%和41.89%。（3）研究了不同培养时间、pH、温度、原油初始浓度、辅助碳源和辅助氮源6个因素对4株高效机油降解菌降解率的影响。结果表明，在最佳条件下，JZ6的最高降解率为60.63%，JZ18的最高降解率为53.28%，JZ41的最高降解率为52.19%，JZ50的最高降解率为56.34%。对筛选出的4株机油降解菌进行随机组合组建复合菌群，由菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50组合形成的复合菌群K机油i 降解率达到最高，为66.87%。将4株菌株在含单一组分十二烷、十六烷、十八烷、二十二烷、苯、萘、芘和菲的不同石油烃组分中培养，观察生长特性，结果表明4株菌株均能以十二烷，十六烷，十八烷，苯和萘为唯一碳源生长，JZ6和JZ50还能在含芘和菲的培养基中生长。GC-MS分析机油残油组分，发现原油主要组分为直链烷烃，其次为支链烷烃、环烷烃，以及一定量的芳香烃和非烃类物质，菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50对总烷烃的降解率分别达到69.72%、48.00%、51.00%和62.20%，对直链烷烃的降解率分别为86.89%、55.98%、58.42%和89.13%，表明4株菌对烷烃具有很强的降解效果，其中菌株JZ6和JZ50对除烷烃的其他芳香烃类物质也具有一定的降解作用。关键词：机油降解菌；16SrRNA；紫外分光光度法；GC-MSii AbstractInrecentyears,withthedevelopmentofpetroleumandpetroleumindustry,oilpollutionisbecomingaseriousproblem,butafractionoftheoilisveryimportantasoil,iswidelyusedinmachinerymanufacturing,maintenanceandotherindustries,alargenumberofoilywastewaterproducednotonlypollutetheenvironment,butalsotohumanbeingsandotherlivingbringgreatharm.Theseparationanddomesticationofefficientoildegradingbacteriahasbecomeanimportantresearchdirectioninthebioremediationofoilpollutedenvironment.Inthisstudy,soilsampleswerecollectedfromlong-termoilpollutantsbyvariousHanzhoungtoolsfactorywastewatertreatmentplantinternalactivatedsludge,preliminaryisolationofoildegradationbacteria,furtherscreenedoildegradingstrains,andtheoildegradingstrainswerestudiedthedegradationcharacteristics.Theresultsofthestudyareasfollows:(1)Atotalof36strainsofbiodegradableoilwereisolatedfromoilpollutedenvironment.TheywereJZ2~JZ4,JZ6~JZ15,JZ17~JZ18,JZ21~JZ24,JZ26~JZ28,JZ30,JZ32,JZ34,JZ36~JZ37,JZ39,JZ41,JZ43~JZ45,JZ47~JZ49andJZ50.Respectively,Fromthebiochemicaltestsand16SrRNAgenesequencehomologyanalysis,physiologicalandbacterialmorphologyobservationandof36strainsofoildegradingstrainsontheidentificationresultsfortheDyadobacter、Massilia、Arthrobacter、Acidovorax、Pseudomonas、Ochrobactrum、Hydrogenophaga、Perlucidibaca、Rhodobacter、Stenotrophomonas、Sphingobacterium、Paracoccus、CatellibacteriumandShinellazoogloeoides.(2)Determinationof36strainsofoildegradationofoildegradationbacteriascreenedtherate,screened4strainsofoildegradingbacteria,respectively.StrainJZ6,JZ18,JZ41,JZ50,7dinculturemediumat30mediumcontainingcrudeoil,theoildegradationratewere42.16%,33.94%,33.75%and41.89%.(3)Theeffectsof6factors,suchasdifferentculturetime,pH,temperature,initialconcentrationofcrudeoil,auxiliarycarbonsourceandauxiliarynitrogensource,onthedegradationrateof4highefficiencyoildegradingbacteriawerestudied.Theiii resultsshowthatundertheoptimumconditions,thehighestdegradationrateofJZ6is60.63%,thehighestdegradationrateofJZ18is53.28%,thehighestdegradationrateofJZ41is52.19%,andthehighestdegradationrateofJZ50is56.34%.Theselected4strainsofoildegradingbacteriawererandomlysetuptoformcompoundbacteriagroup.TheKoildegradationrateofthecompositebacteriagroupformedbythecombinationofstrainJZ6,JZ18,JZ41andJZ50reachedthehighest,whichwas66.87%.4strainswereculturedindifferentoilcomponentscontainingtwelvealkane,sixteenalkane,eighteenalkane,twenty-twoalkane,benzene,naphthalene,pyreneandphenanthrene,andthegrowthcharacteristicswereobserved.Theresultsshowedthat4strainscouldgrowwithtwelvealkane,sixteenalkane,eighteenalkane,benzeneandnaphthaleneastheonlycarbonsource,andJZ6andJZ50couldalsogrowinthemediumcontainingpyreneandphenanthrene.GC-MSanalysisofoilresiduecomponentsshowedthatthemaincomponentsofcrudeoilweredirectalkanes,followedbybranchedalkanes,naphthenichydrocarbons,acertainamountofaromatichydrocarbonsandnonhydrocarbons.ThedegradationratesofJZ6,JZ18,JZ41andJZ50tototalalkaneswere69.72%,48%,51%and62.20%respectively,andthedegradationrateofdirectalkaneswas86.respectively.89%,55.98%,58.42%and89.13%showedthat4strainshadastrongdegradationeffectonalkanes,ofwhichstrainsJZ6andJZ50hadcertaindegradationeffectsonotheraromatichydrocarbonsexceptalkanes.KeyWords:UVspectrophotometry;Oildegradingbacteria;16SrRNA;GC-MSiv 目录第1章绪论..................................................................................................................11.1石油污染及危害...............................................................................................21.1.1石油的简介.............................................................................................21.1.2石油污染................................................................................................21.1.3石油污染带来的危害............................................................................21.2石油污染的处理技术......................................................................................21.2.1物理法....................................................................................................31.2.2化学法....................................................................................................31.2.3生物修复法.............................................................................................31.3利用微生物修复石油污染的国内外研究进展..............................................41.3.1降解石油的微生物种类........................................................................41.3.2石油污染微生物修复技术类型............................................................41.3.2.1原位修复技术...............................................................................41.3.2.2异位修复技术...............................................................................51.3.3利用基因工程构建石油高效降解菌....................................................51.4影响石油降解菌作用的因素..........................................................................61.4.1石油烃种类的影响.................................................................................61.4.2各微生物种类的不同对石油降解效果的影响.....................................61.4.3生物表面活性剂的添加对石油降解效果的影响.................................71.4.4环境因素对石油降解菌降解效率的影响............................................71.5研究目的及意义..............................................................................................81.6技术路线........................................................................................................10第2章机油降解菌的分离、鉴定..........................................................................112.1实验材料与仪器设备....................................................................................112.1.1实验材料..............................................................................................112.1.2仪器与设备..........................................................................................112.1.3实验试剂..............................................................................................12v 2.1.4主要培养基..........................................................................................122.2方法................................................................................................................132.2.1机油降解菌株分离..............................................................................132.2.2机油降解菌的鉴定..............................................................................142.2.2.1机油降解菌形态特征观察.........................................................142.2.2.2机油降解菌的革兰式染色........................................................142.2.2.3机油降解菌的生理生化特征分析.............................................152.2.2.4机油降解菌的16SrRNA分子鉴定.........................................162.3结果与分析....................................................................................................182.3.1机油降解菌株的分离结果...................................................................182.3.2机油降解菌株的鉴定结果...................................................................182.3.2.1机油降解菌的形态特征观察及革兰式染色结果.....................182.3.2.2机油降解菌的生理生化测试结果.............................................202.3.2.3机油降解菌株的16SrRNA分子鉴定结果..............................232.4小结与讨论....................................................................................................27第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究............................................293.1实验材料与仪器设备....................................................................................293.1.1实验材料..............................................................................................293.1.2主要实验仪器......................................................................................293.1.3主要培养基..........................................................................................293.2试验方法........................................................................................................303.2.1高效机油降解菌的筛选......................................................................303.2.2高效机油降解菌降解特性的研究......................................................313.2.2.1环境因素对高效机油降解菌降解机油的影响.........................313.2.2.2复合菌群对高效机油降解菌降解机油的影响.........................323.2.2.3高效机油降解菌株在不同机油组分中的生长特性.................333.2.2.4高效机油降解菌株降解特性研究.............................................333.3结果与分析....................................................................................................343.3.1高效机油降解菌株的筛选结果...........................................................34vi 3.3.2高效机油降解菌降解特性的研究......................................................373.3.2.1环境因素对机油降解菌株的影响............................................373.3.2.2复合菌群对高效机油降解菌降解效果的影响.........................463.3.2.3不同石油组分中菌株的生长特性............................................473.3.2.4机油高效降解菌株降解特性的研究.........................................483.4小结与讨论....................................................................................................51第4章全文结论........................................................................................................55参考文献......................................................................................................................57攻读硕士学位期间学术成果......................................................................................67致谢..........................................................................................................................69vii 第1章绪论第1章绪论随着石油开采及石油工业的发展，石油污染已成为人类越来越重视的问题，难以降解的石油及石油类制品长期在土壤及水体中，在对环境造成破坏的同时，也影响人类的健康，甚至对整个生态环境造成威胁[1-2]。研究学者们致力于如何更好地解决石油污染这一重大难题，而解决石油污染问题研究最多的是通过一系列化学及物理方法，但存在着二次污染、成本较高等诸多问题[3-4]。随之兴起了一种高效、经济和生态可承受的绿色清洁技术——生物修复技术，其主要包括两大类，植物修复技术和微生物修复技术[5-9]。植物修复技术石油降解能力强，但植物的生长周期较长，修复效率慢，无法直接快速的分解石油，微生物修复技术不仅能很好的解决此类问题，且存在着光谱、高效、稳定、适应性强诸多优点，同时有些菌株能很好的适应强酸强碱等极端环境，这些是植物达不到的，所以利用微生物降解石油已成为石油污染土壤治理及环境保护的研究热点[10-12]。自然界中存在着许多微生物，他们不需特意的驯化培养，能够吸收石油及其产品为自身所需的碳源和能源来促进自身生长代谢，这类微生物统称为土著微生物[13]，土著微生物在微生物学研究领域较为常见。目前已经发现能降解石油的微生物有200多种[14]，其中细菌、放线菌、真菌等微生物均可使石油烃类化合物得到降解。降解石油烃类化合物的细菌主要有：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、微杆菌属(Mierobaeterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、假单胞菌属(Pseudomonas)等，其中假单胞菌对于污染土壤中石油烃类的降解治理研究较多，它对烷烃及芳香烃类均具有较好的降解作用；降解石油烃类化合物的放线菌中主要有：分支杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、放线菌属(Actinomycetes)等，其中研究较多的是诺卡氏菌属；降解石油烃类化合物的真菌主要有：金色担子菌(Aureobasidium)、红酵母属(Rhodotorula)、假丝酵母属(Candidd)等[12-14]，其中研究最多的是假丝酵母，因为它营养要求低，生长繁殖快且降解效果显著[15-18]。通过从自然环境中分离培养出能够高效降解石油的菌株进而治理石油污染是环境保护方面的一个热点[19-23]。1 陕西理工大学硕士学位论文1.1石油污染及危害1.1.1石油的简介石油，通常所说的石油是指未经提炼加工的原油，属于复杂混合物，经提炼加工后可以制成多种化工原料，如润滑油（也称机油），汽油，沥青和挥发油等。主要组成元素有碳、氢、硫、氮和氧，其中碳和氢是组成石油的主体，占石油组成元素成份的90%左右，主要成烃类化合物存在。石油是由各种烷烃、环烷烃、芳香烃等组成的烃类物质，所以又称石油烃[24-28]。1.1.2石油污染现代社会是一个工业不断发展的社会，随着现代工业的发展，无处不见石油及石油类产品，石油逐渐成为现代社会的主要能源，广泛应用于生产及生活的各个领域，包括农业、工业生产，交通运输等行业，有着工业“血液”之称，目前，全球每年石油产出总量已超过30亿吨[29-30]。然而在石油开采过程中由于技术水平的限制，加工、运输环节的非正常泄漏，造成土壤及水体的污染[31-32]。1.1.3石油污染带来的危害土壤有机质的组成和结构被进入到土壤中的石油类物质改变从而影响土壤的通透性，土壤中的微生物及植物受土壤中有机质的影响，导致作物产量和品质显著下降，石油中的苯系物质和多环芳烃等多种物质具有致癌、致畸、致突变三致作用，这些污染土壤中的石油烃类物质在粮食农作物中长时间的积累，经食物链的传递进入人体，久而久之影响人体健康，甚至危害生命[33-35]。1.2石油污染的处理技术目前，石油污染土壤的治理已引其人们的高度重视，而解决石油污染问题研究最多的是通过一系列物理及化学方法，包括常见的热处理法、隔离法、吸附法和土壤洗涤法等，但均存在二次污染、成本较高等诸多问题。随之兴起了一种即经济又高效且生态可承受的绿色清洁技术——生物修复技术，与治理土壤石油污染的传统方法相比，其具有操作简单，成本低廉，不破坏土壤环境，无二次污染且处理效果好等多种优点[36]。本文着重介绍了生物修复技术中主要的微生物修复技术及其主要的影响因素，以期为石油污染环境的治理及生态修2 第1章绪论复提供参考。1.2.1物理法石油污染环境修复技术中常用的是物理法，主要包括隔离法、热处理法和吸附法[37]。其中，隔离法主要是指土壤置换法，是通过机械手段将污染土壤移除，填入新鲜的未经污染土壤的修复技术[38]，此技术许耗费大量的人力、物力及财力，仅适用于小面积的土壤修复，如核污染地区[39]；焚烧法是指将不易降解的污染物进行焚烧来解决环境污染，如生活垃圾、白色无然等[40]，此技术存在二次污染问题，破坏气体环境同时还会产生一些有毒有害物质；吸附法主要指生物炭吸附，日常生活中常见的木炭以及动物粪便炭等都可作为生物炭，用来吸附污染环境中难以降解的有机物质，同时还能作为土壤改良剂，改善土壤肥力，在土壤环境修复中存在很大的应用前景，然而，生物炭只能将污染物固定，不能将污染物从环境中彻底中降解移除[41-42]。1.2.2化学法石油污染环境修复技术中另一种常用的方法是化学法，常见的有化学氧化法、萃取法和光催化降解等[43-44]。其中，化学氧化法主要是添加高锰酸钾、臭氧、芬顿试剂和过氧化氢等这类的化学氧化剂到石油污染环境中[45-46]，但是在利用化学氧化剂治理环境污染时，也同时存在破坏环境理化性质，造成二次污染的风险[47]；萃取法是根据相似相溶原理，利于有机化学试剂（如植物油、有机溶液和超临界流体等）对污染环境按照一定步骤进行萃取，在利用萃取法修复环境污染时，应多选用植物油这样具有较好生物降解性的萃取剂进行修复，以避免二次污染[48-50]。1.2.3生物修复法广义的生物修复技术包括植物修复技术，微生物修复技术以及植物-微生物联合修复技术[51]，狭义的生物修复技术仅仅指微生物修复技术[52]。植物修复技术对石油烃类物质降解能力强，但植物生长周期较长，无法直接快速的分解石油烃类物质，降解效率慢，且植物生长对土壤环境要求较高，大部分对于土壤肥力、水分和酸碱度等均有较高要求；植物-微生物联合修复技术，修复效率高，但成本及技术要求相对较高，且影响因素多，影响植物、微生物的因素均能影响其修复效果[53]；而微生物修复技术不仅能很好的解决此类问题，且存在3 陕西理工大学硕士学位论文着光谱、高效、稳定、适应性强诸多优点，且有些菌株能很好的适应强酸强碱等极端环境，这些是植物达不到的，所以利用微生物降解有机油以成为石油污染土壤治理及环境保护的研究热点[54]。1.3利用微生物修复石油污染的国内外研究进展1.3.1降解石油的微生物种类至今为止，研究者发现有200多种微生物可降解石油烃类化合物的，其中细菌、放线菌、真菌等微生物均可使石油烃类化合物得到降解。降解石油烃类化合物的细菌主要有[52]：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、无色杆菌属(Achromobacte)、节杆菌属(Archrobacter)、鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium）、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alealigenes)、Shinellazoogloeoides、芽抱杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Coryneforms)、微杆菌属(Mierobaeterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、假单胞菌属(Pseudomonas)等，其中假单胞菌对于污染土壤中石油烃类的降解治理研究较多，它对烷烃及芳香烃类均具有较好的降解作用；降解石油烃类化合物的放线菌中主要有：分支杆菌(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、放线菌属(Actinomycetes)等，其中研究较多的是诺卡氏菌属；降解石油烃类化合物的真菌主要有：金色担子菌(Aureobasidium)、红酵母属(Rhodotorula)和假丝酵母属(Candidd)等[12-13,52]，其中研究最多的是假丝酵母，因为它营养要求低，生长繁殖快且降解效果显著[55]。1.3.2石油污染微生物修复技术类型石油污染环境的微生物修复技术可分为直接在污染环境所在地进行处理的原位生物修复技术和将污染源移到其他地方进行处理的异位生物修复技术两大类，这两类修复技术是按修复地点所分的[56]。1.3.2.1原位修复技术直接在污染场地就地修复污染土壤不用将石油污染土壤移位的修复技术，主要方法有3种（1）生物培养法：也称生物刺激法，菌株来源为土著微生物，该方法是定期的向污染土壤中添加电子受体、表面活性剂和营养物质等添加剂以提高土壤中原有的微生物的繁殖及活性，从而提高其石油降解能力[57]。4 第1章绪论[58]－Kuiperi等向石油污染土壤中投加适量的NO3、O2及H2O2等电子受体以及N、P等营养元素，观察几天后污染土壤中石油降解速率提高且石油降解菌丰富度显著增加。（2）生物强化法：也称投菌法，菌株来源为外源降解菌，通常为具有石油高降解能力的驯化菌或工程菌，并且提供充足的营养物质[59]。GrazynaA等[60]从石油污染土壤中分离驯化出一株石油烃降解菌株，研究发现其对难以降解的芳香烃化合物有较高的降解作用，改善其生物环境，如温度、营养元素、pH值等可加快其对芳香烃化合物的降解。Mikhail等[61]从石油污染的沉积物中分离筛选出一株以沥青为唯一碳源的菌株Sphingomonassp.VKMB-2434，将该菌投入到多环芳烃污染环境中，在300h内该菌株可以降解285mg/L的菲。（3）生物通气法：将空气通入污染土壤区块，使土壤中的挥发性污染物有效去除，有利于提高土壤中石油降解菌的降解活性。1.3.2.2异位修复技术异位修复技术指将石油污染土壤从原地挖出运至指定地点进行处置的修复技术，主要方法有两种。（1）生物反应器法：在反应器装置内装入受污染的土壤进行处理，反应器可使土壤中分离出已被驯化的微生物及其他添加物如营养盐，表面活性剂等彻底混合，能够控制好微生物降解石油污染物时所需条件，从而提高微生物降解石油的效率，达到处理目标后，将土壤排出、脱水再运回原地[62]。（2）土壤堆肥法：土壤堆肥法是将石油污染土壤挖出运输到处理场地，向石油污染物中加入树叶，干草，麦秸，木屑，粪肥等农业废弃物质，并用石灰调节pH，保持氧气、水分和pH的最适值，为微生物提供营养及最适环境，以提高其代谢及活性，促进石油污染物的降解，降解过程为提高效果需要引入驯化的石油高降解微生物或工程菌[63]。这种修复技术成本低，易操作且效率高，是现在石油污染土壤处理常用的方法。Trejo-Hernandez等[64]研究了堆肥（猪粪）、枯枝烂叶和甘蔗渣等废弃物对微生物降解石油烃的促进作用，结果表明这种农业废弃物作为添加剂可以较好的促进石油污染土壤环境中土著微生物的生长，促进石油烃的降解，在10~15d可以降解40%初始浓度为10000mg/kg的石油烃物质。1.3.3利用基因工程构建石油高效降解菌用于污染土壤石油降解的微生物大部分为环境土壤中原有的微生物（也称5 陕西理工大学硕士学位论文土著微生物），有降解石油能力的单一菌株或复合微生物菌群，单一菌株由于环境因素及自身代谢活性原因降解石油能力会有局限性，复合微生物菌群因菌株各自生长对营养物质的需求发生菌株间的相互抑制或竞争能影响石油降解能力，构建高效的基因工程菌成为了解决此问题的关键[65-66]。在利用微生物治理石油污染土壤研究方面，越来越多的国内外学者致力于构建高效的石油降解基因工程菌[67-68]。构建基因工程菌的方法包括多质粒新菌株构建法[69]、原生质体融合技术[70]、体外重组技术[71]。Plotnikova等[72]人利用质粒新菌株构建法将一株多环芳烃降解菌假单胞菌SN11中的多环芳烃降解性质粒移入到嗜盐性恶臭假单胞菌BS394中，构建出的基因工程菌可以在盐浓度达到2.5M的环境时仍具有较高的降解多环芳烃类化合物的能力。1.4影响石油降解菌作用的因素1.4.1石油烃种类的影响石油烃是由各种烷烃、环烷烃、芳香烃等组分构成的混合烃类物质，其主要构成元素是碳（C）和氢（H），此外还含有铁（Fe）、镁（Mg）、锌（Zn）、钾（K）等多种微量元素。石油烃类化合物可分为沥青、树脂、芳香烃和饱和烃四种类型，一般情况下其降解的难易程度为：高分子量芳烃类>多环烷烃>低分子量芳烃类>支链烷烃>饱和烷烃，其中高分子量芳烃类对微生物的作用最不敏感，只有少数的菌株能利用降解它，支链烷烃和饱和烷烃较易分解[73]。1.4.2各微生物种类的不同对石油降解效果的影响微生物由于其本身生长特性的差异，每种微生物都有对特定的石油烃中的某种成分降解能力较强，不同种属的微生物对石油烃的降解效率不同，如罗小艳[74]所分离出的一株Massiliasp.WFl菌株对多环芳烃中菲的降解，在培养温度28℃、pH6、菲初始浓度100mg/L，培养48h菲的降解率达96.78%，伍凤姬[75]等分离出一株芘高效降解菌Mycobacteriumgilvumstrain，在芘初始浓度为75mg/L、温度范围在30~35℃，pH值为7的条件下，芘的降解率可达到95%以上。赵硕伟[76]等研究表明，由所分离出的两株红球菌属，一株大头茶菌属和一株假单胞菌属组成的复合菌群D，石油烃降解能力超过其中任何单一菌株，在6 第1章绪论培养5d后，复合菌群D能够降解71%的芳香化合物和70%石油总量，对于C13-19烷烃，C[77]20-26烷烃和C27-32烷烃降解能力达到90%以上。1.4.3生物表面活性剂的添加对石油降解效果的影响由微生物代谢产生的具有一定表面活性的物质叫做生物表面活性剂。其与化学合成的表面活性剂相比，它具有适应范围广、无毒、能被微生物降解，对环境无二次污染，耐酸碱能力强且稳定性好等多种优点，现代生物修复技术中越来越多的采用生物表面活性剂[78]。在微生物修复石油污染土壤过程中添加生物表面活性剂是近几年发展起来的土壤石油污染修复技术，生物表面活性剂具有润湿、乳化和增溶等作用，无毒、对环境无二次污染，且在作用后能被微生物降解，通常加入生物表面活性剂在微生物修复过程中通过减小难以降解的石油烃类物质和水溶液间的表面张力[56]，从而更好的降解污染物[79]。牛明芬[80]等从大庆油田土壤中分离出3株产表面活性剂的细菌菌株B22、B24、B25，三株菌株生物表面活性剂不仅具有较高的耐高温、耐酸碱能力，对石油烃类物质均具有较好的降解效果，处理72h后对石油烃的降解分别为62.31%、81.69%和71.38%。1.4.4环境因素对石油降解菌降解效率的影响微生物的生长及代谢除了需要营养物质外，合适的环境生存因子也是十分重要的[52]，在适宜的环境下，微生物吸收利用石油中的一些组分将其分解为CO2和H2O从而起到降解石油的作用，微生物在适宜环境条件下生长及代谢速度会加快，促进其活性从而促进石油的降解，不适宜微生物生长的环境则相反，会抑制微生物活性从而抑制石油的降解[81]。影响石油降解菌降解效率的环境因素主要有培养温度、时间，培养基初始pH和石油浓度等。经研究石油降解菌细菌的培养温度根据菌种的不同，最适温度范围为30~37℃，极端环境下的菌株除外。从理论上来讲，随着培养时间的增加细菌对石油的降解会更加彻底，但时间也不宜过长，过长的时间由于次生代谢物质的积累会抑制细菌进一步生长[12]，所以菌株培养时间要控制在一定范围内，一般为5~10d，菌株机油降解率不仅能够达到最好效果，且株菌投入生产时，时间短，效益高[82]。此外，偏酸性或弱碱性的环境均不利于菌株的机油降解，经研究培养基的初始pH控制在5.0~8.0，石油降解菌的降解效率最高[83]。张秀霞等[84]研究结果表明，菌株SM-17 陕西理工大学硕士学位论文和菌株MM-7在pH为7石油降解效率最高，低于或高于7时降解率都会下降，SM-1菌株的接种量在10%降解率达到最高，低于或高于此接种量降解率下降，对于菌株MM-7最适接种量为20%。马强[85]研究结果表明所分离出的两株石油烃降解菌株B1、B2温度为35℃时，石油烃降解率达到最高，分别为50.2%和76.2%，提高或降低温度降解率都会受到影响；pH不同菌株B1、B2的石油烃降解率也明显不同，pH为7时，两株菌的机油降解率达到最高，分别为78.2%和69.4%，pH为8时，两株菌株的机油降解率在30~40%，pH为9时，两株菌株的机油降解率仅为10~20%；此外C，H，O，N，P等不同营养元素添加量的不同也对菌株的机油降解率有很大影响。1.5研究目的及意义目前，石油污染环境的治理以引其人们的高度重视，而解决石油污染问题研究最多的是通过焚烧法、萃取法等一系列物理及化学方法[13]，但均存在二次污染、成本较高等诸多问题。随之兴起了一种即经济又高效且生态可承受的绿色清洁技术——生物修复技术，与治理土壤石油污染的传统方法相比，其具有操作简单，成本低廉，不破坏土壤环境，无二次污染且处理效果好等多种优点[86]。机油是石油制品中应用较为广泛的一种，主要包括含油分的基础油成分和辅助其发挥功能的添加剂成分。基础油大致可分为矿物油、合成油和植物油等几类[51]，这也是根据机油制品所发挥功能的不同而分的，其中矿物油应用最为广泛，在生活、工业生产及机器制造中常见。添加剂则是为了配合不同基础油的化学特性而添加的助剂，从而更好地发挥基础油的化学特性及功能，种类广泛。机油在工业生产中多作为润滑油，起到润滑机械保护机械的作用，但其两种成分都难以降解，在使用及运输过程中，不可避免地会产生泄露和废弃[51,70]，难以降解的机油不仅对环境造成污染，也很大程度的对人类健康造成危害。目前，对于广泛石油的研究报道较多，但针对机油这类特殊的石油制品进行生物降解的研究鲜见报道。本研究以石油的重要馏分——20#机油为唯一碳源，研究土壤样品采于长期受各种机油类物质污染的汉中某工具厂污水处理车间，经多次富集驯化培养初步分离出机油降解菌，对机油降解菌株进行鉴定，对各菌株机油降解率进行计8 第1章绪论算，根据菌株降解率的不同进一步筛选出高效机油降解菌株，探究不同培养时间、pH、温度、原油初始浓度、辅助碳源和辅助氮源6个因素对高效机油降解菌降解率的影响。使菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50随机组合，组建复合菌群，测定各组合菌群的机油降解率。并对菌株的降解特性进行了研究，为利用微生物治理环境污染方面研究提供参考。9 陕西理工大学硕士学位论文1.6技术路线机油污染地区土壤样品的采集富集培养分离、纯化、筛选、鉴定菌株机油降解率测定Ducan多重比较筛选出高效机油降解菌株探究不同培养时GC-MS测定高间、pH、温度、原复合菌群的构效机油降解菌油初始浓度、外加建及其降解效作用后的残油辅助碳源和辅助果的研究组分，研究降氮源对高效机油解菌的主要降降解菌降解效果解组分。的影响利用微生物治理机油污染环境10 第2章机油降解菌的分离、鉴定第2章机油降解菌的分离、鉴定2.1实验材料与仪器设备2.1.1实验材料本试验土壤样品采集于陕西省汉中市某工具厂污水处理车间，分别在活性污泥、污水沟、活性污泥带沙3个不同地点采集样品。将所采集活性污泥样品在-20℃冷冻保藏，以备后续实验所需。实验所用原油为20#机油。2.1.2仪器与设备表2-1所示为本章实验所用的主要仪器与设备表2-1主要仪器设备及型号Table2-1Maininstrumentsandmodels仪器名称型号生产厂家全自动高压蒸汽灭菌锅ML-3751L-PC日本TomyDigitalBiology公司净化工作台SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司超纯水净化系统SUPL上海申分分析仪器有限公司电热恒温培养箱DHP-9162上海慧泰仪器制造有限公司电热恒温干燥箱101-1AS上海实验仪器厂有限公司智能恒温摇床JBZL08常州普天仪器制造有限公司加热磁力搅拌器RCTBasicpackage1德国IKA公司PCR扩增仪TECHEN上海天能科技有限公司凝胶电泳仪TANONEPS300上海天能科技有限公司全自动化学发光和荧光凝Alliance4.7英国UVItec胶成像系统电子分析天平MP2000D上海华科实验器材有限公司显微镜成像系统北京中显徕卡显微镜北京中显恒业仪器仪表有限公司显微镜奥林巴斯CX22普赫光电（上海）科技有限公司移液枪348578A德国Eppendorf公司11 陕西理工大学硕士学位论文2.1.3实验试剂表2-2所示为本章实验所用的主要试验试剂。表2-2主要生化试剂及来源Table2-2Sourceofmainbiochemicalreagentsusedinthisstudy常规试剂分子试剂牛肉浸粉（BeefExtract）根际土壤细菌DNA提取试剂盒胰蛋白胨（tryptone）乙二胺四乙酸（EDTA）氯化钠（NaCl）二甲苯青FF（XyleneCyanolFF）琼脂糖（Agarose）溴酚蓝（BromophenolBlue）氢氧化钠（NaOH）Trisbase结晶紫100%Triton磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）琼脂糖硫酸铵（(NH4)2SO4）溴化乙锭（EB）硫酸镁（MgSO4）Buffer缓冲液氯化钙（CaCl2）dNTP醋酸引物E-27F和1492R草酸铵溶菌酶无水乙醇Taq酶2.1.4主要培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸粉（BeefExtract）3.0g，胰蛋白胨（Tryptone）10.0g，氯化钠（NaCl）5.0g，蒸馏水（H2O）1000.0mL，琼脂（Agar）18.0g。MSM培养基（基础培养基）：磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）1.0g，硫酸铵（(NH4)2SO4）2.0g，硫酸镁（MgSO4）0.5g，氯化钙（CaCl2）0.02g，磷酸二氢钾（KH2PO4·3H2O）1.0g，氯化钠（NaCl）4.0g，微量元素母液1.0mL，蒸馏水（H2O）1000.0mL，琼脂（Agar）18.0g。微量元素母液配置：蒸馏水（H2O）100.0mL，氯化铁（FeCl3）1.2g，氯化锌（ZnCl2）0.3g，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.1g，氯化铜（CuCl2）0.3g，钼酸铵（H8MoN2O4）0.1g，硫酸锰（MnSO4）0.3g。12 第2章机油降解菌的分离、鉴定原油：20#机油。糖发酵培养基（葡萄糖、蔗糖、乳糖）：蛋白胨（Peptone）10.0g，牛肉膏3.0g，各种糖类（葡萄糖、蔗糖、乳糖）5~10g，氯化钠（NaCl）5.0g，溴酚蓝指示剂10.0mL，蒸馏水（H2O）1000.0mL，将上述成分混合后，加热溶解，pH7.2。葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）0.2g，蒸馏水100.0mL，pH7.2~7.4。蛋白胨水培养基：蛋白胨1.0g，氯化钠（NaCl）0.5g，蒸馏水（H2O）100.0mL，pH7.6。西蒙斯氏柠檬酸盐培养基：氯化钠（NaCl）5.0g，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）1.0g，磷酸二氢铵（(NH4)H2PO4）1.0g，柠檬酸钠2.0g，琼脂（Agar）12.0g，溴酚蓝1%水溶液10.0mL，蒸馏水（H2O）990.0mL。柠檬酸铁铵培养基：蛋白胨20.0g，氯化钠（NaCl）5.0g，柠檬酸铁铵0.5g，次亚硫酸（Na2S2O3）0.5g，琼脂（Agar）15~20g，蒸馏水（H2O）1000.0mL，pH7.2。苯丙氨酸培养基：酵母浸膏3.0g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）1.0g，DI－苯丙氨酸2.0g，氯化钠（NaCl）5.0g，琼脂（Agar）12.0g，蒸馏水（H2O）1000.0mL。2.2方法2.2.1机油降解菌株分离（1）将采集于3个不同污染地点的样品（活性污泥、污水沟、活性污泥带沙）分别称取10g左右，各放入已灭菌的装有100mL无菌水的150mL的三角瓶中，放入摇床160rpm振荡10min。（2）按终浓度为机油1g/L的100mLMSM培养液的三角瓶中加入5mL步骤（1）中样品上清液，30℃，160rpm震荡培养7d。（3）7d后移取步骤（2）菌液5mL，加入含机油1g/L的100mLMSM培养液的三角瓶中，重复以上步骤，进行富集培养3次。（4）将步骤（3）富集后的菌液进行适当稀释，吸取5mL摇匀的菌液到13 陕西理工大学硕士学位论文盛装45mL无菌水的50mL已灭菌的塑料离心管中，上下充分摇匀，以此制成10-1的稀释液，再由10-1的稀释液中吸取5mL到盛装45mL无菌水的50mL已灭菌的塑料离心管中，上下充分摇匀，制成10-2的稀释液。以此类推制成所需的浓度。（5）吸取步骤（4）中所得10-1、10-2、10-3的稀释液各100µl，涂布于含机油1g/L的MSM固体培养基平板上，置于30℃生化培养箱中，观察并纪录。带菌落长好后，选择形态特征不同且具有透明圈的菌落[77]，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行多次划线进行分离纯化，得到纯种菌株。（6）将分离得到的纯种菌株相应地重新转接至含终浓度为机油1g/L的MSM培养液中，30℃，160rpm震荡培养7d，观察其是否能以机油为唯一碳源生长[77]，以含机油1g/L而不接种的MSM培养液为对照。（7）将能使含终浓度为机油1g/L的MSM培养液变浑浊的纯菌株进行甘油保藏。2.2.2机油降解菌的鉴定2.2.2.1机油降解菌形态特征观察将所得菌株制成菌悬液适当稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨平板，培养观察其生长情况，菌落形态（包括菌落颜色、大小、菌落边缘是否整齐、隆起度、透明度及湿润度等）。2.2.2.2机油降解菌的革兰式染色将分离得到的细菌单菌落进行革兰氏染色，主要分为涂片、固定、初染、媒染、脱色、复染和镜检，具体操作步骤如下：（1）用接种环在培养的细菌平板上挑取单菌落，均匀地涂在滴有生理盐水的载玻片上，自然风干。（2）将步骤（1）中自然风干的涂有菌落的载玻片通过火焰2~3次进行固定。（3）滴一滴草酸铵结晶紫溶液在固定好的载玻片上，染色2min，结束后用蒸馏水轻缓的冲洗干净。（4）在步骤（3）冲洗后的菌落上滴加一滴碘液，媒染1min结束后用蒸14 第2章机油降解菌的分离、鉴定馏水轻缓的冲洗干净。（5）用95%乙醇，进行脱色20~30s，脱色过程中轻轻摇晃玻片，结束后水洗至流出液无紫色液体。（6）滴加蕃红复染液，复染1~2min，水洗，用吸水纸印干后，进行显微镜观察。（7）将制作好的切片放在显微镜下观察细菌的革兰式染色情况。2.2.2.3机油降解菌的生理生化特征分析利用糖类发酵试验、甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、吲哚试验、接触酶试验、氧化酶活性、明胶液化试验、淀粉水解试验等实验对菌株进行生理生化特性分析。（1）糖类发酵试验将各被检测菌株分别接种到葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基和蔗糖发酵培养基，每组三组平行样并作空白对照，37℃培养24h~48h，呈现黄色者为阳性，蓝色为阴性[87-88]。（2）甲基红试验（M.R试验）将各被检测菌株接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，每组三组平行样并作空白对照，37℃培养24h~48h，加甲基红指示剂2~3滴，待反应数秒后立即观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色或橘黄色者为阴性[88-89]。（3）乙酰甲基甲醇试验（VP试验）将各被检测菌株接种到葡萄糖蛋白胨水中，每组三组平行样并作空白对照，37℃培养24h~48h，加入40%氢氧化钠5~7滴，轻摇混匀，再用接种针挑取少量肌酸，充分震荡混匀，为了促使其反应速度加快，再放入37℃培养箱中放置30min。若培养物呈现红色，为乙酰甲基甲醇试验阳性[88]。（4）吲哚试验将各被检测菌株接种到蛋白胨水培养基中，每组三组平行样并作空白对照，37℃培养24h~48h后，在培养物中滴加吲哚试剂7~10滴，轻轻摇动充分混匀，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性[88,90]。（5）接触酶试验15 陕西理工大学硕士学位论文用接种环挑取各被检测菌株于洁净载玻片上，每组三组平行样并作空白对照，加3％的H[88]2O21~3滴，观察结果。出现大量气泡为阳性，无气泡为阴性。（6）氧化酶试验用接种环挑取各被检测菌株于洁净载玻片上，滴加1%盐酸二甲基对苯二，反应10~30s，呈深紫色为阳性，无变化着为阴性[88]。（7）明胶液化实验将各被检测菌株穿刺接种于明胶培养基，于20℃培养7d，每天定时观察明胶液化现象，如室温高，可与冰箱内放置30min以防止培养基自行溶化，然后取出观察结果，若培养基为液体且不再凝固时为阳性[88,91]。（8）淀粉水解试验将各被检测菌株分别接种到淀粉培养基平板中，每组三组平行样并作空白对照，37℃培养24h，加碘液使其铺满平板，观察结果，有透明圈出现者为阳性，无透明圈者为阴性[88,92]。2.2.2.4机油降解菌的16SrRNA分子鉴定（1）机油降解菌的DNA提取菌株DNA提取参见细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工生物有限公司）。DNA纯化参见DNA纯化试剂盒（上海生工生物有限公司）。（2）机油降解菌株的16SrRNA扩增采用细菌通用引物（正向引物27F及反向引物1492R）进行PCR扩增，PCR引物设计、反应体系、扩增条件及分析软件如表2-3、表2-4、表2-5和表2-6所示，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。所得PCR产物电泳检测后送上海生工生物技术有限公司进行正、反双向测序，16SrRNA测序结果提交至NCBI进行比对，细菌16SrRNA测序结果提交至BLAST进行比对，选取同源性较高的相似菌株，下载其16SrRNA基因序列，测序结果使用DNAMAN软件剪切整理，通过MEGA6.0软件，依照Neighbor-Joining聚类，以1000个重复进行Bootstrap值分析[93]。16 第2章机油降解菌的分离、鉴定表2-3PCR引物Table2-3PrimersforPCR名称序列作用27fAGAGTTTGATCCTGGCTCAG细菌PCR扩增1492rTACGGCTACCTTGTTACGACTT细菌PCR扩增2-4PCR反应体系Table2-4PCRreactionsystem总体积50µL10µME-27F5µL10µM1492R5µL2.5mMdNTP2µLBuffer缓冲液2µL模板DNA1µLTaq酶0.25µLddH2O34.75µL表2-5细菌16SrRNA扩增条件Table2-5BacteriaPCRconditionof16SrRNA反应步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火55℃30s33×延伸72℃1min后延伸72℃2min表2-6分析软件Table2-6Analysissoftware名称版本或网址BLASThttps://blast.ncbi.nlm.nih.govNCBIBanklthttps://www.ncbi.nlm.nih.govMEGAVersion6.017 陕西理工大学硕士学位论文2.3结果与分析2.3.1机油降解菌株的分离结果污染土样经富集驯化后，分离出108株能能以原油为唯一碳源生长的菌株，筛选出其中降解圈较明显且菌落形态不同的36株菌株，编号JZ2、JZ3、JZ4、JZ6、JZ7、JZ8、JZ9、JZ10、JZ11、JZ12、JZ13、JZ14、JZ15、JZ17、JZ18、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ26、JZ27、JZ28、JZ30、JZ32、JZ34、JZ36、JZ37、JZ39、JZ41、JZ43、JZ44、JZ45、JZ47、JZ48、JZ49和JZ50。如图2-1A是第三次富集培养的菌悬液，图2-1B是菌株JZ18利用机油出现的透明圈现象，图2-1C是JZ18单菌株能使以机油为唯一碳源的MSM培养基变浑浊的验证。同样方法筛选出其他35株机油降解菌，最后将筛选出的有机油降解菌株进行甘油保藏。图2-1菌株的分离与初筛结果Fig.2-1Theseparationandpreliminaryresultsofstrains2.3.2机油降解菌株的鉴定结果2.3.2.1机油降解菌的形态特征观察及革兰式染色结果按照方法2.2.2.1和2.2.2.2中描述的方法，对初筛出的36株机油降解菌株进行形态特征观察及革兰氏染色，图2-2A为JZ6的菌落形态图，图2-2B为JZ6电镜下的革兰氏染色图，由图可见JZ6菌落颜色为淡橘黄色，干燥，隆起度高，菌落边缘不整齐，革兰氏呈阴性，球状。同样观察其他的35株机油降解菌的形态特征，结果见表2-7。18 第2章机油降解菌的分离、鉴定图2-2菌株菌落形态及革兰氏染色Fig.2-2ColonymorphologyandGramstainofstrain表2-7菌株形态特征观察及革兰氏染色结果Table2-7Observationofthemorphologicalcharacteristicsofthestrainsandtheresultsofgramstaining菌落边缘是菌株编号菌落颜色隆起度透明与否湿润度革兰氏染色否整齐JZ2橘黄色平整齐否干燥G+杆状JZ3乳白色平不整齐否干燥G+长链状JZ4淡橘黄色平较整齐否干燥G+链状JZ7淡橘黄色平整齐否干燥G-链状JZ8橘黄色平较整齐否干燥G-长链状JZ9淡橘黄色隆不整齐是湿润G+杆状JZ10淡橘黄色平较整齐否干燥G+短链状JZ11淡橘黄色平整齐否干燥G+短链状JZ12乳黄色平不整齐否湿润G-杆状JZ13橘黄色隆不整齐是湿润G-杆状JZ14白色平较整齐否干燥G+长链状JZ15橘黄色平整齐否干燥G+杆状JZ17乳黄色隆整齐否湿润G-长链状JZ18橘黄色隆不整齐半透明湿润G+杆状19 陕西理工大学硕士学位论文表2-7菌株形态特征观察及革兰氏染色结果（续）Table2-7Observationofthemorphologicalcharacteristicsofthestrainsandtheresultsofgramstaining(continued)菌落边缘是菌株编号菌落颜色隆起度透明与否湿润度革兰氏染色否整齐JZ21乳黄色平较整齐否干燥G+链状JZ22乳黄色平整齐否干燥G+链状JZ23乳白色平不整齐否干燥G+链状JZ24乳黄色隆较整齐否湿润G+球状JZ26橘黄色隆整齐否干燥G-杆状JZ27乳白色平较整齐否湿润G+链状JZ28黄色平较整齐否干燥G+长链状JZ30乳白色隆不整齐是湿润G+杆状JZ32乳白色平不整齐否干燥G+球状JZ34乳黄色平不整齐否干燥G+球状JZ36黄色平不整齐否干燥G+短链状JZ37黄色平不整齐否干燥G-短链状JZ39橘黄色平整齐否干燥G-长链状JZ41淡橘黄色平不整齐否干燥G-长链状JZ43乳黄色平整齐否干燥G-长链状JZ44乳黄色平整齐否干燥G-短链状JZ45乳黄色平不整齐否干燥G+杆状JZ47乳白色平整齐是干燥G+长链状JZ48淡橘黄色平不整齐否干燥G-短链状JZ49乳黄色平较整齐否干燥G-短链状JZ50淡橘黄色隆整齐否干燥G+长链状注：G+表示革兰氏染色为阳性，G-表示革兰氏染色为阴性。2.3.2.2机油降解菌的生理生化测试结果按照方法2.2.2.3中的方法，对机油降解菌株进行生理生化测试，结果见表20 第2章机油降解菌的分离、鉴定2-8。表2-8菌株生理生化实验Table2-8Physiologicalandbiochemicalexperimentofstrains生理葡萄乙酰乳糖蔗糖甲基接触氧化明胶淀粉生化糖发甲基吲哚发酵发酵红试酶试酶试液化水解菌株酵试甲醇试验实验试验验验验试验试验编号验试验JZ2＋－－＋－－－－＋RJZ3＋－－＋－－－－＋RJZ4＋－－＋－－－－＋RJZ6R－－－＋－＋－＋＋JZ7－－＋－＋－＋－＋＋JZ8－－－R－－＋－－＋JZ9－－－R－－＋－－＋JZ10－－－R－－＋－－＋JZ11－－－R－－＋－－＋JZ12RR－－－－－＋＋＋JZ13＋＋＋－＋－＋＋－－JZ14＋＋＋－＋－＋＋－－JZ15＋＋＋－＋－＋＋－－JZ17＋－－＋－－－R－RJZ18RR－－－－－＋＋＋JZ21＋＋＋－＋－＋＋－－JZ22＋＋＋－＋－＋＋－－JZ23＋＋＋－＋－＋＋－－JZ24＋＋＋－＋－＋＋－－JZ26－－－R＋－＋－＋＋JZ27＋＋＋－＋－＋＋－－JZ28＋＋＋－＋－＋＋－－JZ30＋＋＋－－＋－＋－＋JZ32－－R＋＋－－－－－21 陕西理工大学硕士学位论文表2-8菌株生理生化实验（续）Table2-8Physiologicalandbiochemicalexperimentofstrain(continued)生理葡萄乙酰乳糖蔗糖甲基接触氧化明胶淀粉生化糖发甲基吲哚发酵发酵红试酶试酶试液化水解菌株酵试甲醇试验实验试验验验验试验试验编号验试验JZ34－－R＋＋－－－－－JZ36R＋＋－－－－－－＋JZ37－－R＋＋－－－－－JZ39＋＋＋－＋－＋＋－－JZ41＋＋＋－＋－＋＋－－JZ43＋＋＋－－＋－＋－＋JZ44＋＋＋－－＋－＋－＋JZ45R＋＋－－－＋＋－RJZ47R－－－－－－－＋＋JZ48R－－－－－－－＋＋JZ49R＋＋－－－＋＋－RJZ50＋－－－＋－－－－－注：＋：试验结果为阳性；－：试验结果为阴性；R：试验结果为弱阳性由表2-8，生理生化测试结果可知，在葡萄糖发酵试验中，菌株JZ2、JZ3、JZ4、JZ13、JZ14、JZ15、JZ17、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ27、JZ28、JZ30、JZ39、JZ41、JZ43、JZ44和JZ50呈阳性反应，菌株JZ6、JZ12、JZ18、JZ36、JZ45、JZ47、JZ48和JZ49呈弱阳性反应，其余菌株呈阴性反应；在乳糖发酵试验中，菌株JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ27、JZ28、JZ30、JZ36、JZ39、JZ41、JZ43、JZ44、JZ45、JZ49呈阳性反应，菌株JZ12和JZ18呈弱阳性反应，其余菌株呈阴性反应；在蔗糖发酵试验中，菌株JZ7、、JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ27、JZ28、JZ30、JZ36、JZ39、JZ41、JZ43、JZ44、JZ45、JZ49呈阳性反应，JZ32、JZ33、JZ34、JZ37呈弱阳性反应，其余菌株呈阴性反应；在甲基红试验过程中，菌株JZ2、JZ3、JZ4、JZ17、JZ32、JZ34、JZ37呈阳性反应，菌株JZ8、JZ9、JZ10、JZ11、JZ26呈弱阳性反应，22 第2章机油降解菌的分离、鉴定其他菌株呈阴性反应；在乙酰甲基甲醇试验试验过程中，菌株JZ6、JZ7、JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ26、JZ27、JZ28、JZ32、JZ34、JZ37、JZ39、JZ41、JZ50呈阳性反应，其他菌株呈阴性反应；在吲哚试验中，菌株JZ30、JZ43、JZ44呈弱阳性反应，其他菌株呈阴性反应；在接触酶试验中，菌株JZ6、JZ7、JZ8、JZ9、JZ10、JZ11、JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ26、JZ27、JZ28、JZ39、JZ41、JZ45、JZ49呈弱阳性反应，JZ17呈弱阳性反应，其余菌株呈阴性反应；在明胶液化试验中，菌株JZ2、JZ3、JZ4、JZ5、JZ6、JZ7、JZ12、JZ18、JZ26、JZ47、JZ48呈阳性反应，其他菌株成阴性反应；在淀粉水解试验中，菌株JZ6、JZ7、JZ8、JZ9、JZ10、JZ11、JZ12、JZ18、JZ26、JZ30、JZ36、JZ43、JZ44、JZ47、JZ48呈阳性反应，菌株JZ2、JZ3、JZ4、JZ17、JZ45、JZ49呈弱阳性反应，其他菌株成阴性反应。2.3.2.3机油降解菌株的16SrRNA分子鉴定结果（1）机油降解菌株的16SrRNA扩增结果利用方法2.2.2.4中所述方法，对上述所得菌株进行DNA提取（上海生工DNA提取试剂盒），并使用细菌通用引物27f及1492r进行16SrRNAPCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行验证，约在1500bp有清晰片段，部分PCR扩增电泳结果见图2-3。图2-3菌株PCR扩增结果Fig.2-3TheresultofstrainsPCRamplification23 陕西理工大学硕士学位论文（2）机油降解菌株的16SrRNA分子鉴定将测序得到的各菌株16SrRNA序列通过NCBI中的BLAST进行比对，找出同源相似性较高并已在核心期刊及国际权威杂志上公开发表的序列进行对比分析，结果见表2-9。将所得的各序列剪切后构建系统发育树，结果见图2-4。表2-9菌株鉴定结果Table2-9Identificationresultofstrains相似序列登GenBanK菌株编号相似属种相似度录号登录号JZ2DyadobacterKY117482.199%KY996843JZ3DyadobacterMF765313.199%KY996844JZ4DyadobacterLN890052.199%KY996845JZ6MassiliaFJ786054.197%KY996847JZ7Arthrobacter（节细菌属）KY117482.199%KY996848JZ8Acidovorax（食酸菌属）MF101692.1100%KY996849JZ9Acidovorax（食酸菌属）GQ284421.198%KY996850JZ10Acidovorax（食酸菌属）GQ284418.199%KY996851JZ11Acidovorax（食酸菌属）GQ284429.198%KY996852JZ12Pseudomonas（假单胞菌属）LT629797.199%KY996853JZ13Ochrobactrum（苍白杆菌属）KT380663.198%KY996854JZ14Ochrobactrum（苍白杆菌属）LT796201.199%KY996855JZ15Ochrobactrum（苍白杆菌属）KY741543.197%KY996856JZ17Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）AB795530.198%KY996888JZ18Pseudomonas（假单胞菌属）KP682488.199%KY996857JZ21Ochrobactrum（苍白杆菌属）KX778110.197%KY996862JZ22Ochrobactrum（苍白杆菌属）KT380663.199%KY996863JZ23Ochrobactrum（苍白杆菌属）KY770707.198%KY996864JZ24Ochrobactrum（苍白杆菌属）MF347452.1100%KY996865JZ26Acidovorax（食酸菌属）KX243306.198%KY996867JZ27Ochrobactrum（苍白杆菌属）MG457705.198%KY99686824 第2章机油降解菌的分离、鉴定表2-9菌株鉴定结果（续）Table2-9Identificationresultofstrains(continued)相似序列登GenBanK菌株编号相似属种相似度录号登录号JZ28Ochrobactrum（苍白杆菌属）MF347452.199%KY996869JZ30PerlucidibacaJX458465.199%KY996890JZ32Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）KU375545.199%KY996871JZ34Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）GQ916535.198%KY996873JZ36Rhodobacter（红杆菌属）EU839358.197%KY996875JZ37Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）LT223687.197%KY996876JZ39Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）KP979546.197%KY996877JZ41Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）MG198989.197%KY996866JZ43PerlucidibacaJX458465.197%KY996881JZ44PerlucidibacaJF216977.199%KY996882JZ45Paracoccus（副球菌属）HQ877783.198%KY996883JZ47CatellibacteriumKU977287.199%KY996885JZ48CatellibacteriumFJ773999.199%KY996886JZ49Paracoccus（副球菌属）EF575566.197%KY996887JZ50ShinellazoogloeoidesAB698675.198%KY99685825 陕西理工大学硕士学位论文JZ18(KY996857)95Pseudomonas(FN652314)JZ12(KY996853)100Pseudomonas(NR116992)96Pseudomonas(KM281943)JZ43(KY996881)Perlucidibaca(KU233248)100JZ44(KY996882)9899Perlucidibaca(DQ664237)Shinellazoogloeoides(LC177122)79Shinellazoogloeoides(AB698675)99JZ50(KY996858)Shinellazoogloeoides(KX161838)89Shinellazoogloeoides(KF145132)99JZ49(KY996887)92JZ45(KY996883)93Paracoccus(FR848417)97Paracoccus(DQ337586)Paracoccus(EF575566)Hydrogenophaga(AB636293)82Hydrogenophaga(HQ652594)JZ17(KY996888)Massilia(KX301306)Massilia(FJ267553)97JZ6(KY996847)71Massilia(FJ786054)Massilia(AY157759)99JZ41(KY996866)Sphingobacterium(LT009506)98JZ3(KY996844)95JZ4(KY996845)98Dyadobacter(KY117482)81Dyadobacter(KY117484)Acidovorax(GQ284421)Acidovorax(MF101692)80JZ8(KY996849)9897JZ9(KY996850)88JZ24(KY996865)Ochrobactrum(KY741543)JZ22(KY996863)100JZ23(KY996864)63Ochrobactrum(LT796201)图2-4菌株系统发育树Fig.2-4PhylogenetictreeofStrains26 第2章机油降解菌的分离、鉴定如表2-9所示，菌株JZ2、JZ3和JZ4为Dyadobacter；菌株JZ6为Massilia；菌株JZ7为Arthrobacter（节细菌属）；菌株JZ8、JZ9、JZ10、JZ11和JZ26为Acidovorax（食酸菌属）；JZ12和JZ18为Pseudomonas（假单胞菌属）；菌株JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ27和JZ28为Ochrobactrum（苍白杆菌属）；JZ17为Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）；菌株JZ30、JZ43和JZ44为Perlucidibaca；菌株JZ36为Rhodobacter（红杆菌属）；菌株JZ32、JZ34和JZ37为Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）；JZ39和JZ41为Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）；JZ45和JZ49为Paracoccus（副球菌属）；JZ47和JZ48为Catellibacterium；菌株JZ50为Shinellazoogloeoides。其中，Ochrobactrum（苍白杆菌属）的菌株数量最多，占所筛选出的机油降解菌总数的25%，其次为Acidovorax（食酸菌属），其数量约占所筛选出的机油降解菌总数的14%，Massilia、Arthrobacter（节细菌属）、Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）、Rhodobacter（红杆菌属）、Shinellazoogloeoides的菌株数量较少，各约占总菌株数量的3%。2.4小结与讨论本章主要是分离、初步筛选出菌株能以机油为唯一碳源生长的机油降解菌株，经富集培养，分离，筛选出36株机油降解菌株，这36株菌株经鉴定分别属于Dyadobacter；Massilia；Arthrobacter（节细菌属）；Acidovorax（食酸菌属）；Pseudomonas（假单胞菌属）；Ochrobactrum（苍白杆菌属）；Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）；Perlucidibaca；Rhodobacter（红杆菌属）；Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）；Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）；Paracoccus（副球菌属）；Catellibacterium和Shinellazoogloeoides等14个菌属。其中Pseudomonas（假单胞菌属）、Ochrobactrum（苍白杆菌属）在生物修复中利用微生物治理环境领域已有很多的报道。利用微生物治理生活中难以自然降解的机油污染已经成为机油污染环境生物处理技术的重要手段，从机油污染的环境中筛选机油高效降解菌，通过富集培养及驯化后用于机油污染土壤及废水的生物处理[83]，能够达到高效且节约成本的目的。自然界中存在着许多微生物，他们不需特意的驯化培养，能够吸收27 陕西理工大学硕士学位论文石油及其产品为自身所需的碳源和能源从而促进生长代谢，这类微生物统称为土著微生物[13]，这类微生物在微生物学研究领域较为常见[83]，目前已经发现能降解石油的微生物有200多种[13-14]，其中细菌、放线菌、真菌等微生物均可使石油烃类化合物得到降解。降解石油烃类化合物的细菌主要有：嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)、微杆菌属(Mierobaeterium)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、假单胞菌属(Pseudomonas)等。苏莹[94]等从山东胜利油田的机油污染水体中分离出10株降解机油的细菌，培养6d后，其中最高机油降解率为54.74%，其余菌株均在40%以下。孙华庆[95]等从首钢焦化厂的污水处理系统中分离1株能降解吡啶的菌株BC026，经鉴定为Shinellazoogloeoides菌属，当吡啶浓度为1800mg/L，投菌量为0.06g/L时，BC026可在46h内将吡啶完全降解。机油的化学组成成分非常复杂且难以降解，由于机油的基础油及添加剂的组成成分及各成分之间的比例各不相同，因此不同地区机油样品中所分离出的微生物种类以及微生物对于机油的降解性差异性很大，这就要求在实验科研过程中，针对目标修复的机油污染物筛选出机油降解率较高的微生物种类。本研究是以20#机油为唯一碳源，针对汉中某工具厂水处理车间长期受各类机油及其制品污染的内部活性污泥中筛选可用于生物修复的高效机油降解菌，从机油污染地区采集了分别为活性污泥、污水沟、活性污泥带沙三种机油污染样品，用于机油降解菌株的富集分离，采用含有较高浓度机油（1g/L）的液体MSM培养基对污染土壤中的微生物进行富集驯化培养，经过连续3个周期共15d的培养，对能够耐受高浓度机油环境并利用机油类物质生长的微生物起到了同时富集和驯化的作用。28 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究3.1实验材料与仪器设备3.1.1实验材料实验所筛选出的36株机油降解菌株。3.1.2主要实验仪器本章实验所用的主要实验仪器见表3-1。表3-1主要仪器及型号Table3-1maininstrumentsandmodels仪器名称型号生产厂家全自动高压蒸汽灭菌锅ML-3751L-PC日本TomyDigitalBiology公司净化工作台SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司超纯水净化系统SUPL上海申分分析仪器有限公司电热恒温培养箱DHP-9162上海慧泰仪器制造有限公司电热恒温干燥箱101-1AS上海实验仪器厂有限公司智能恒温摇床JBZL08常州普天仪器制造有限公司加热磁力搅拌器RCTBasicpackage1德国IKA公司GC-MS气质联用仪Thermo-H2GAJD美国赛默飞世尔科技公司紫外分光光度计4802S龙尼科上海仪器有限公司移液枪348578A德国Eppendorf公司3.1.3主要培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸粉（BeefExtract）3.0g，胰蛋白胨（tryptone）10.0g，氯化钠（NaCl）5.0g，蒸馏水1000.0mL，琼脂（Agar）18.0g。MSM培养基（基础培养基）：磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）1.0g，硫酸铵（(NH4)2SO4）2.0g，硫酸镁（MgSO4）0.5g，氯化钙（CaCl2）0.02g，磷酸二氢钾（KH2PO4·3H2O）1.0g，氯化钠（NaCl）4.0g，微量元素母液1.0mL，蒸29 陕西理工大学硕士学位论文馏水1000.0mL，琼脂（Agar）18.0g。微量元素母液配置：蒸馏水100.0mL，氯化铁（FeCl3）1.2g，氯化锌（ZnCl2）0.3g，氯化钴（CoCl2·6H2O）0.1g，氯化铜（CuCl2）0.3g，钼酸铵（H8MoN2O4）0.1g，硫酸锰（MnSO4）0.3g。原油：20#机油。3.2试验方法3.2.1高效机油降解菌的筛选（1）紫外分光光度仪测定机油最大吸收波长：取配置好的100mg/mL的原油溶液，将其稀释配成浓度为40g/L的原油溶液10mL，然后用紫外紫外分光光度计，以石油醚为参比测定其吸收曲线，确定最大吸收波长[12,29]。（2）标准曲线绘制：取9个50mL的容量瓶，以“原油”为溶质，以石油醚为溶剂。准确地配制浓度依次为4.0mg/L，8.0mg/L，12.0mg/L，16.0mg/L，20.0mg/L，24.0mg/L的系列样品，同时做试剂空白，依次测定上述系列样品的吸光度，重复3次，取其平均值。得出方程式：y=ax+b[12,16]。（3）液体培养基中残余机油的测定：向被测样品中加入盐酸和硫酸各0.5mL进行酸化处理，轻轻震荡后将被测样品移入250mL分液漏斗中，充分震荡摇匀，震荡其间注意不断放气，防止酸化作用下气体过多，约1min后静置，加入石油醚10mL对各样品中的机油进行萃取，充分振摇3min（振摇过程中注意防止分液漏斗漏液降低实验准确率），静置数分钟分层，结束后将分液漏斗上面的玻璃塞打开，下面的水层移入其他容器中，石油醚萃取液通过已铺有无水硫酸钠的砂芯漏斗（除去有机相中的水）滤入25mL容量瓶内。将上一步骤中放出的水层溶液移回分液漏斗中，加入10mL石油醚重复萃取一次，以保证液体培养基中残留的机油成分充分萃取出来，步骤如上，再用石油醚洗涤分液漏斗，以防剩余残油，保证试验准确性，洗出液收集于同一容量瓶内，稀释至标线并摇匀。用移液枪吸取上述步骤所制备的含机油萃取液取100μl，用石油醚稀释至25mL，在选定的机油最大吸收波长处，以石油醚为参比测量其ABS值，根据标准曲线计算残余机油浓度，通过以下公式计算机油降解率[55]。30 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究C0C机油降解率100%C0注：C0为未接菌的空白对照的机油浓度，C为机油降解菌降解后的残余的机油浓度。3.2.2高效机油降解菌降解特性的研究3.2.2.1环境因素对高效机油降解菌降解机油的影响（1）培养时间对菌株降解机油的影响配置MSM培养基后调节pH为7.4，含机油浓度1.0g/L，将待测菌株接入，置于转速160rpm，温度30℃的摇床中，培养1d，2d，3d，4d，5d，6d，7d，8d，9d，每组设3组空白样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定有机油的残留浓度，考察培养时间对菌株降解机油的影响[16]。（2）温度对菌株降解机油的影响配置MSM培养基后调节pH为7.4，含机油浓度1.0g/L，将待测菌株接入，分别置于20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃转速为160rpm恒温振荡器中培养7d，每组设3组平行样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定有机油的残留浓度，考察温度对菌株降解机油的影响[96]。（3）pH对菌株降解机油的影响配置MSM培养基，用1mol/L的HCl或NaOH调好pH分别为（5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0），含有机油浓度为1.0g/L，置于转速160rpm，温度30℃的摇床中培养7d，每组设3组平行样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定有机油的残留浓度，考察不同pH对菌株降解机油的影响[97]。（4）机油初始浓度对菌株降解机油的影响配置MSM培养基后调节pH为7.4，改变原油的添加量，使机油初始浓度分别为0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L，置于转速160rpm，温度30℃的摇床培养7d，每组设3组平行样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定有机油的残留浓度，考察机油初始浓度对菌株降解机油的影响[98-99]。（5）辅助碳源的添加对菌株降解机油的影响31 陕西理工大学硕士学位论文在原油培养基中分别添加3g/L辅助碳源：葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸，并设置不添加辅助碳源的空白对照，将待测菌株分别接种至pH为7.4含有机油1.0g/L的添加各辅助碳源和空白对照的MSM培养基中，在30℃，转速160rpm的恒温振荡器中培养7d，每组设3组平行样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定有机油的残留浓度，考察辅助碳源的添加对菌株降解机油的影响[100-101]。（6）辅助氮源的添加对菌株降解机油的影响在原油培养基中分别添加10g/L辅助氮源：蛋白胨、酵母粉、尿素，并设置不添加辅助氮源的空白对照，将待测菌株分别接种至pH为7.4含有机油1.0g/L的添加各辅助氮源和空白对照的MSM培养基中，在30℃，转速160rpm的恒温振荡器中培养7d，每组设3组平行样，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定机油的残留浓度，考察辅助氮源的添加对菌株降解机油的影响[102-104]。3.2.2.2复合菌群对高效机油降解菌降解机油的影响为了考察不同菌株之间协同作用降解机油的效果，对筛选出的4株机油降解菌JZZ6、JZ18、JZ41和JZ50进行随机组合组建复合菌群[105-106]，按照表3-2所示的试验方案，吸取4株机油降解菌的种子液混合，使每种组合菌液按6%的添加量加到终浓度为机油1g/L的100mLMSM培养液中，形成复合菌群[107-110]，30℃、160rpm震荡培养7d，培养结束后，用石油醚萃取培养液，测定机油的残留浓度，比较各复合菌群的机油降解效果。32 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-2复合菌群的构建方案Tab.3-2Constructionofcompoundbacteriagroup各菌株接种量（%）菌群编号JZ6JZ18JZ41JZ50A33--B3-3-C3--3D-33-E-3-3F--33G222-H22-2I2-22J-222K1.51.51.51.53.2.2.3高效机油降解菌株在不同机油组分中的生长特性将待测菌株接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，于30℃，160rpm振荡培养2d，12000rpm离心2min，收集菌体，用生理盐水冲洗两遍后加入100μl无菌水重悬，分别接种于单一组分的十二烷、十六烷、十八烷、二十二烷、苯、萘、芘和菲为唯一碳源的MSM培养基中，30℃，160rpm培养5d，取样稀释、涂平板计数，计算在不同机油组分中细菌生长数，每组3个平行，并作空白对照[111-113]。3.2.2.4高效机油降解菌株降解特性研究（1）待测样品的预处理GC-MS测定前，先对待测样品进行预处理，用正己烷萃取对含油样品进行萃取并定容，萃取方法见方法3.2.1，最后用正己烷定容至25mL的容量瓶刻度线。移液枪吸取2.5mL过滤置2.5mL的GC-MS棕色进样瓶中，待分析[114-115]。（2）GC-MS测定33 陕西理工大学硕士学位论文色谱条件：色谱条件为DB-5MS毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm；在柱温为50℃条件下保持3min程序升温；待仪器稳定后，分别以15℃/min、8℃/min的升温速率逐步升到120℃、260℃，恒温25min，设置载气氦气，进样口温度250℃，柱流量1mL/min[116-117]。质谱条件：质谱条件为传输线温度260℃，离子源温度250℃，MSD离子源为EI源，电离电压：70eV；质量扫描范围m/z35-650amu[118]。3.3结果与分析3.3.1高效机油降解菌株的筛选结果（1）最大吸收波长的测定使用紫外分光光度计测量样品的吸收值时，选择该物质的最大吸收波长作为入射波长可以使测量结果具有更高的灵敏度和准确度，因为在此波长处测量，样品的“吸收最大，干扰最小”。由于机油的化学组成因其产地不同而有差别，不同机油样品的特征吸收波长也不尽相同，因此须对试验研究的机油样品进行波长扫描，以确定其最大吸收波长。以石油醚为参比，原油样品在200~800nm的全波长扫描如图3-1。从图3-1可以看出样品在235nm左右有最大吸收波长。图3-1机油样品光谱扫描图Fig.3-1Thespectralscanofthesampleofoil34 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究（2）原油标准曲线测定石油醚稀释原油样品，使其浓度分别为4.0mg/L、8.0mg/L、12.0mg/L、16.0mg/L、20.0mg/L、24.0mg/L，依次测量系列标准溶液的OD235值，结果见表3-3，根据各浓度标准溶液所测得的ABS值绘制标准曲线，见图3-2。从图可见，以吸光度值（y）为纵坐标，以机油标准溶液为横坐标，得出方程y=0.0187x-0.0061，R2为0.9993，OD值与机油浓度呈良好的线性相关。表3-3机油各浓度的ABS值Table3-3ABSvalueofoilconcentration浓度（mg/L）4812162024ABS值0.0710.1430.2140.2950.3620.446图3-2原油标准曲线Fig.3-2Standardcurveofcrudeoil（3）高效机油降解菌的筛选按照3.2.1中描述的方法对初筛的36个菌株进行机油降解能力的复筛。在紫外分光光度计上测量机油溶液的OD235nm处的ABS值，计算各菌株的机油降解率，利用SPSS22.0软件对实验结果进行方差分析和多重比较，结果见表3-4。35 陕西理工大学硕士学位论文表3-4各菌株机油降解率的差异显著性检验Table3-4Differencesignificancetestofoildegradationrateofeachstrains菌株编号机油降解率（%）菌株编号机油降解率（%）JZ224.992.64JJZ2413.031.98CJZ318.050.72FGHJZ2614.691.03CDEJZ414.791.34CDEFJZ279.190.68ABJZ642.161.59LJZ2823.360.82IJJZ79.530.62BJZ306.441.00ABJZ823.060.46IJJZ3215.001.43CDEFJZ917.501.67EFGHJZ3423.230.84IJJZ109.340.62ABJZ3625.180.81JJZ1120.501.77HIJZ3725.713.59JJZ126.360.98ABJZ3913.120.74CDJZ1323.461.44IJJZ4133.752.13KJZ1424.830.55JJZ4316.350.38DEFGJZ156.150.83AJZ4414.831.34CDEFJZ1717.501.24EFGHJZ4523.190.85IJJZ1833.941.68KJZ4719.061.24GHJZ2118.870.78GHJZ4824.931.53JJZ229.190.68ABJZ4915.191.55CDEFJZ2318.821.13GHJZ5041.890.88L注：数据后不同大写字母A/B/C/D/E/F/G/H/I/J/K/L分别表示各菌株间机油降解率差异极显著（P<0.01）。由表3-4可见，初步筛选的的36个菌株均具有降解机油的作用，原油降解率最高的菌株为JZ6，达到42.16%，最低的是JZ15，原油降解率只有6.15%，不同菌株对机油的降解能力有所不同。其中JZ6、JZ18、JZ41、JZ50这4株菌的石油烃降解率均超过30%，分别为42.16%，33.94%，33.75%，41.89%，利用SPSS22.0软件对实验结果进行方差分析和多重比较结果可知，菌株JZ6、36 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究JZ18、JZ41、JZ50与其他菌株的机油降解率具有极显著差异（P<0.01），机油降解率高且差异性呈极显著，因此选取这4株菌株为机油高效降解菌株。3.3.2高效机油降解菌降解特性的研究3.3.2.1环境因素对机油降解菌株的影响（1）培养时间对菌株机油降解力的影响按照3.2.2.1中描述的方法，测定培养时间对菌株机油降解力的影响，结果见图3-3。表3-5培养时间对菌株机油降解率的影响Table3-5Theinfluenceofincubationtimeforstraintheoildegradationrate天数1d2d3d4d5d6d7d8d9d菌株JZ66.4813.8128.0933.5538.9239.9242.6243.2744.50（%）0.91.62.11.61.71.81.41.41.2JZ186.677.1611.1819.3124.8229.1233.6734.3034.57（%）1.72.61.51.72.41.61.71.71.2JZ414.128.8020.8526.5329.1431.5133.3634.9035.33（%）3.31.61.20.92.72.01.41.41.3JZ505.8810.1121.2027.4236.6539.0640.5241.0240.20（%）0.90.91.31.92.40.90.90.80.8图3-3培养时间对菌株机油降解率的影响Fig.3-3Theinfluenceofincubationtimeforstrainstheoildegradationrate37 陕西理工大学硕士学位论文从图3-3可以看出，在一定培养时间内，培养时间越长，机油降解率越高，机油降解率随培养时间的增加慢慢趋近于平缓，菌株JZ6在培养第1d机油降解率为6.48%，在培养第2d机油降解率为13.81%，在培养第3d机油降解率为28.09%，在培养第4d机油降解率为33.55%，在培养第5d机油降解率为38.92%，在培养第6d机油降解率为39.92%，在培养第7d机油降解率为42.62%，在培养第8d机油降解率为43.27%，在培养第9d机油降解率为44.50%，可见菌株JZ6在1~5d机油降解率增长较快，第5d后，机油降率增长较平缓，处于较稳定状态。菌株JZ18在培养第1d机油降解率为6.67%，在培养第2d机油降解率为7.16%，在培养第3d机油降解率为11.18%，在培养第4d机油降解率为19.31%，在培养第5d机油降解率为24.82%，在培养第6d机油降解率为29.12%，在培养第7d机油降解率为33.67%，在培养第8d机油降解率为34.30%，在培养第9d机油降解率为34.57%，可看出，菌株JZ18在1~3d机油降解率增长较慢，在4~7d增长较快，7d后，机油降率增长较平缓，处于较稳定状态。菌株JZ41在培养第1d机油降解率为4.12%，第2d机油降解率为8.80%，第3d机油降解率为20.85%，第4d机油降解率为26.53%，第5d机油降解率为29.14%，第6d机油降解率为31.51%，第7d机油降解率为33.36%，第8d机油降解率为34.90%，第9d机油降解率为，可看出菌株JZ41在1~7d机油降解率增长较快，第7d后，机油降率增长较平缓，处于较稳定状态。菌株JZ50在培养第1d机油降解率为5.88%，第2d机油降解率为10.11%，第3d机油降解率为21.20%，第4d机油降解率为27.42%，第5d机油降解率为36.65%，第6d机油降解率为39.06%，第7d机油降解率为40.52%，第8d机油降解率为41.02%，第9d机油降解率为40.20%，在第6d前机油降解率增长较快，6d后机油降率增长较平缓，处于较稳定状态。该结果表明在利用微生物治理环境污染过程中要注意时间的控制，保证短时高效的进行生物降解。（2）培养温度对菌株机油降解率的影响按照3.2.2.1中描述的方法，测定培养温度对菌株机油降解力的影响，结果见图3-4。38 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-6培养温度对菌株机油降解率的影响Table3-6Theinfluenceofculturetemperatureonstrainstheoildegradationrate温度20℃25℃30℃35℃40℃菌株JZ6（%）19.961.623.693.039.812.643.012.029.601.9JZ18（%）10.964.516.963.432.740.631.531.716.642.0JZ41（%）16.733.921.243.932.480.627.810.915.162.3JZ50（%）8.293.328.762.638.941.625.642.215.460.8图3-4培养温度对菌株机油降解率的影响Fig.3-4Theinfluenceofculturetemperatureonstrainstheoildegradationrate从图3-4可以看出不同菌株在不同培养温度下机油降解率有所不同，菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃均具有机油降解能力，但不同温度下机油降解率的高低不同。菌株JZ6在培养温度为35℃时，菌株机油降解率达到最高43.01%，菌株JZ18，JZ41和菌株JZ50在培养温度为30℃时，菌株机油降解率达到最高，分别为32.74%，32.48%，38.94%。该结果表明菌株培养温度要控制在一定范围内（30℃~35℃），机油降解率才能达到最好效果。并且由于土样最初富集培养的温度为30℃，所以4株菌株在30℃时都有较好的机油降解效果。（3）pH对菌株机油降解率的影响按照3.2.2.1中描述的方法，测定培养基初始pH对菌株机油降解率的影响，39 陕西理工大学硕士学位论文结果见图3-5。表3-7pH对菌株机油降解率的影响Table3-7TheinfluenceofpHforstrainstheoildegradationratepH5677.589菌株JZ6（%）17.103.531.311.540.011.442.121.330.443.017.562.2JZ18（%）10.332.117.502.628.141.834.732.124.071.69.123.4JZ4（%）7.871.917.001.934.041.132.241.331.981.511.091.2JZ50（%）9.961.722.632.038.931.841.181.733.011.38.583.2图3-5pH对菌株机油降解率的影响Fig.3-5TheinfluenceofpHforstrainstheoildegradationrate从图3-5可以看出JZ6、JZ18、JZ41和JZ50在培养基初始pH为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0的环境条件下均具有机油降解能力，但不同pH条件下菌株机油降解率高低不同。菌株JZ6、JZ18、JZ50的机油降解率在培养基初始pH7.5时达到最大，分别为42.12%，34.73%，41.18%，菌株JZ41机油降解率在pH7.0时达到最大值34.04%，此外偏弱酸性或弱碱性的环境均不利于菌株的机油降解，要控制培养基的初始pH在7.0~7.5之间。（4）机油初始浓度对菌株降解机油的影响根据3.2.2.1中描述的方法，测定机油初始浓度对菌株降解有机油的影响，结果见图3-6。40 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-8机油初始浓度对菌株机油降解率的影响Table3-8Theinfluenceofinitialoilconcentrationonoildegradationrateofstrains机油浓度0.511.522.534菌株59.2841.0737.2232.3328.5025.3513.49JZ6（%）3.171.740.511.421.390.671.0557.9933.1430.7928.2117.5815.669.78JZ18（%）1.410.650.981.330.750.573.3943.1132.8930.2328.2121.5019.0511.55JZ41（%）0.651.221.061.332.450.590.5855.0141.1035.5431.4130.2124.0212.68JZ50（%）0.650.931.051.041.460.382.95图3-6机油初始浓度对菌株机油降解率的影响Fig.3-6Theinfluenceofinitialoilconcentrationonoildegradationrateofstrains从图3-6可以看出，随着原油浓度的增加，4株菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50的降解机油的能力呈下降的趋势，原油添加量为0.5g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50降解机油的效果最好，分别达到了59.28%，57.99%，43.11%，55.01%，相对于试验中一直所用的添加量1g/L有较大幅的提高，原油添加量为1g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为41.07%，33.14%，32.89%，41.10%，原油添加量为1.5g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为37.22%，41 陕西理工大学硕士学位论文30.79%，30.23%，35.54%，原油添加量为2g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为32.33%，28.21%，28.21%，31.41%，原油添加量为2.5g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为28.50%，17.58%，21.50%，30.21%，原油添加量为3g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为25.35%，15.66%，19.05%，24.02%，原油添加量为3.5g/L时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别为13.49%，9.78%，11.55%，12.68%。随着机油浓度的增加，4株菌株的机油降解能力逐渐降低，从结果中可以看出，较高的机油浓度对微生物降解机油起到一定的抑制作用，原因可能是以机油作为微生物生长所需的唯一碳源，当浓度过高时，对微生物起到了一定的毒害作用，影响或抑制其生长，从而影响了机油降解反应的速度，严重时甚至可使微生物无法降解机油，造成生物修复的不可进行。（5）辅助碳源的添加对菌株降解机油的影响根据3.2.2.1中描述的方法，测定辅助碳源的添加对菌株降解有机油的影响，结果见图3-7。表3-9辅助碳源的添加对菌株机油降解率的影响Table3-9Theinfluenceofsupplementationofauxiliarycarbonsourceonoildegradationrateofstrains辅助碳源葡萄糖蔗糖麦芽糖乳糖淀粉无添加菌株55.37±48.30±37.26±40.56±40.80±41.99±JZ6（%）1.500.281.152.071.710.7045.21±42.98±34.70±34.90±41.27±33.39±JZ18（%）1.651.162.120.982.161.7445.96±40.62±31.19±29.03±36.07±32.74±JZ41（%）2.020.920.542.381.512.4956.34±53.54±50.11±43.32±48.56±42.56±JZ50（%）0.960.270.811.091.061.0942 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究图3-7辅助碳源的添加对菌株机油降解率的影响Fig.3-7Theinfluenceofsupplementationofauxiliarycarbonsourceonoildegradationrateofstrains从图3-7可以看出，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉五种辅助碳源的添加对4株菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50的机油降解率有着不同的影响作用，当以葡萄糖为辅助碳源时，4株菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解的效果最好，机油降解率分别为55.37%，45.21%，45.96%，56.34%，相对于不添加任何辅助碳源以机油为唯一碳源的培养基中菌株的机油降解率有明显地提升。菌株JZ6在以添加葡萄糖为辅助碳源时，机油降解率为55.37%，在以添加蔗糖为辅助碳源时，机油降解率为48.30%，在以添加麦芽糖为辅助碳源时，机油降解率为37.26%，在以添加乳糖为辅助碳源时，机油降解率为40.56%，在以添加淀粉为辅助碳源时，机油降解率为40.80%，不添加任何辅助碳源以机油为唯一碳源，机油降解率为41.99%，可见，对菌株JZ6的机油降解有促进作用的外加辅助碳源为葡萄糖和蔗糖，其中葡萄糖的促进作用最明显，而辅助碳源麦芽糖的添加反而不利于菌株JZ6的机油降解，原因可能是麦芽糖对菌株JZ6的生长代谢产生抑制作用所致，乳糖和淀粉的添加对于菌株JZ6的机油降解无显著影响，原因可能是菌株JZ6不能利用乳糖和淀粉进行生长代谢。菌株JZ18在以添加葡萄糖为辅助碳源时，机油降解率为45.21%，在以添加蔗糖为辅助碳源时，机油降解率为42.98%，在以添加麦芽糖为辅助碳源时，机油降解率为34.70%，在以添加乳糖为辅助碳源时，机油降解率为34.90%，在以添加淀粉为辅助碳源43 陕西理工大学硕士学位论文时，机油降解率为41.27%，不添加任何辅助碳源以机油为唯一碳源，机油降解率为33.39%，可见，辅助碳源葡萄糖、蔗糖和乳糖的添加对菌株JZ18的机油降解均起到一定的促进作用，其中促进作用最明显的为葡萄糖。麦芽糖和乳糖的添加对菌株JZ18的机油降解也起到了微量的促进作用，但作用效果不明显，原因可能是菌株JZ18不能利用这两种碳源所致。菌株JZ41在以添加葡萄糖为辅助碳源时，机油降解率为45.96%，在以添加蔗糖为辅助碳源时，机油降解率为40.62%，在以添加麦芽糖为辅助碳源时，机油降解率为31.19%，在以添加乳糖为辅助碳源时，机油降解率为29.03%，在以添加淀粉为辅助碳源时，机油降解率为36.07%，不添加任何辅助碳源以机油为唯一碳源，机油降解率为32.74%，可见，辅助碳源葡萄糖、蔗糖和乳糖的添加对菌株JZ41的机油降解均起到一定的促进作用，其中促进作用最明显的为葡萄糖，麦芽糖的作用效果不明显，乳糖的添加不利于菌株JZ41的机油降解。菌株JZ50在以添加葡萄糖为辅助碳源时，机油降解率为56.34%，在以添加蔗糖为辅助碳源时，机油降解率为53.54%，在以添加麦芽糖为辅助碳源时，机油降解率为50.11%，在以添加乳糖为辅助碳源时，机油降解率为43.32%，在以添加淀粉为辅助碳源时，机油降解率为48.56%，不添加任何辅助碳源以机油为唯一碳源，机油降解率为42.56%，可见，辅助碳源葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉的添加对菌株JZ50的机油降解均起到一定的促进作用，其中促进作用最明显的为葡萄糖，乳糖的作用效果不明显，原因可能是菌株JZ50不能利用乳糖所致。（6）辅助氮源的添加对菌株降解机油的影响根据3.2.2.1中描述的方法，测定机油初始浓度对菌株降解有机油的影响，结果见图3-8。44 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-10辅助氮源的添加对菌株机油降解率的影响Table3-10Theinfluenceofsupplementationofauxiliarynitrogensourceonoildegradationrateofstrains辅助氮源牛肉粉蛋白胨氯化铵酵母浸粉硝酸钾无添加菌株55.10±60.63±34.76±46.78±41.35±41.67±JZ6（%）1.661.501.851.650.830.6646.35±53.28±43.83±47.47±41.18±34.18±JZ18（%）1.971.360.801.570.581.4046.46±52.19±34.90±40.54±27.95±35.67±JZ41（%）1.391.561.121.862.140.3444.39±50.31±41.69±41.65±47.00±41.33±JZ50（%）0.72.180.640.841.130.74图3-8辅助氮源的添加对菌株机油降解率的影响Fig.3-8Theinfluenceofsupplementationofauxiliarynitrogensourceonoildegradationrateofstrains从图3-8可知，牛肉粉、蛋白胨、氯化铵、酵母浸粉和硝酸钾五种辅助氮源的添加对4株菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50的机油降解率有着不同的影响作45 陕西理工大学硕士学位论文用，当以蛋白胨为辅助氮源时，4株菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50的机油降解达到最高，分别为60.63%，53.28%，52.19%，50.31%。菌株JZ6在以牛肉粉为辅助氮源时，机油降解率为55.10%，在以蛋白胨为辅助氮源时，机油降解率为60.63%，在以氯化铵为辅助氮源时，机油降解率为34.76%，在以酵母浸粉为辅助氮源时，机油降解率为46.78%，在以硝酸钾为辅助氮源时，机油降解率为41.35%，菌株JZ18在以牛肉粉为辅助氮源时，机油降解率为46.35%，在以蛋白胨为辅助氮源时，机油降解率为53.28%，在以氯化铵为辅助氮源时，机油降解率为43.83%，在以酵母浸粉为辅助氮源时，机油降解率为47.47%，在以硝酸钾为辅助氮源时，机油降解率为41.18%，菌株JZ41在以牛肉粉为辅助氮源时，机油降解率为46.46%，在以蛋白胨为辅助氮源时，机油降解率为52.19%，在以氯化铵为辅助氮源时，机油降解率为34.90%，在以酵母浸粉为辅助氮源时，机油降解率为40.54%，在以硝酸钾为辅助氮源时，机油降解率为35.67%，菌株JZ50在以牛肉粉为辅助氮源时，机油降解率为44.39%，在以蛋白胨为辅助氮源时，机油降解率为50.31%，在以氯化铵为辅助氮源时，机油降解率为41.69%，在以酵母浸粉为辅助氮源时，机油降解率为41.65%，在以硝酸钾为辅助氮源时，机油降解率为47.00%。综合上述结果发现，以牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉为辅助氮源时，机油降解率较无添加辅助氮源培养基和以添加氯化铵、硝酸钾的无机氮源辅助培养基机油降解率高，菌株机油降解能力明显，这可能是因为微生物在生长代谢过程中较易利用氨态氮，而有机氮比无机氮更易转化为氨态氮，此外，在菌种保存过程中使用的是牛肉膏蛋白胨培养基，此培养基中的成分有牛肉粉、蛋白胨、氯化钠和琼脂，所以菌株对牛肉粉和蛋白胨的适应性较强，此成分易于其生长代谢，从能促进机油降解。3.3.2.2复合菌群对高效机油降解菌降解效果的影响按照表3.2.2.2中所示的试验方法，按一定的添加量，将4株机油降解菌JZ6，JZ18，JZ41，JZ50进行随机组合，每一组合为一个菌群，恒温振荡培养7d，每个组合设3个重复，测量残余机油含量，进一步计算机油降解率，从中比较机油降解率最高的组合，筛选出该组合。利用SPSS22.0软件对实验结果进行方差分析和多重比较，结果见表3-11。46 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-11复合菌群的机油降解率Table3-11Oildegradationrateofcompoundbacteriagroup菌群编号复合菌群的菌株组成机油降解率（%）AJZ6、JZ1848.642.56EBJZ6、JZ4157.152.11BCCJZ6、JZ5060.160.68BDJZ18、JZ4138.643.69EEJZ18、JZ5050.491.48DEFJZ41、JZ5053.081.54CDGJZ6、JZ18、JZ4154.812.24CHJZ6、JZ18、JZ5061.552.57BIJZ6、JZ41、JZ5061.471.62BJJZ18、JZ41、JZ5059.481.27BKJZ6、JZ18、JZ41、JZ5066.871.57A注：数据后不同大写字母A/B/C/D/E分别表示各复合菌群间机油降解率差异极显著（P<0.01）。从表3-11可知，对机油降解菌进行随机组合形成复合菌群A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K，其中大多数菌群的机油降解率比单菌株的降解率均有提高。由菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50组合形成的复合菌群K机油降解率达到最高，为66.87%。根据SPSS22.0软件对实验结果进行方差分析和多重比较可知，菌群K与其他菌群的机油降解率具有极显著差异（P<0.01），因此，确定由菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50组合形成的复合菌群K为最佳组合。3.3.2.3不同石油组分中菌株的生长特性按照3.2.2.3方法测定不同有机物组分中菌株的生长情况，结果如表3-12。47 陕西理工大学硕士学位论文表3-12菌株在不同有机物组分中的生长Table3-12Growthofstrainsindifferentoilcomponents菌株十二烷十六烷十八烷二十二烷苯萘芘菲JZ6+++++++++++++++++JZ18+++++++++++++－－JZ41+++++++++++－－JZ50+++++++++－+++++注：－：菌落数低于对照组；＋：菌落数超过对照组2倍低于4倍；＋＋：菌落数高于对照组4倍低于6倍；＋＋＋：菌落数高于对照组6倍如表3-12所示，菌株JZ6在以十二烷，十六烷，十八烷为唯一碳源的培养基中生长状况好，在以二十二烷、苯和萘为唯一碳源的培养基中生长状况较好，在以芘和菲为唯一碳源的培养基中生长状况一般；菌株JZ18在以十二烷，十六烷，十八烷为唯一碳源的培养基中生长状况好，在以二十二烷为唯一碳源的培养基中生长状况较好，在以苯和萘为唯一碳源的培养基中生长状况一般，在以芘和菲为唯一碳源的培养基中不生长；菌株JZ41十二烷为唯一碳源的培养基中生长状况好，在以十六烷，十八烷，二十二烷为唯一碳源的培养基中生长状况较好，在以苯和萘为唯一碳源的培养基中生长状况一般，在以芘和菲为唯一碳源的培养基中不生长；菌株JZ50在以十二烷，十六烷，十八烷为唯一碳源的培养基中生长状况好，在以二十二烷为唯一碳源的培养基中不生长，在以萘为唯一碳源的培养基中生长状况较好，在以苯、芘和菲为唯一碳源的培养基中生长状况一般。4株菌株均能以十二烷，十六烷，十八烷，苯和萘为唯一碳源的培养基中生长。3.3.2.4机油高效降解菌株降解特性的研究按照3.2.2.4方法研究机油高效降解菌株对机油具体组分降解，菌株接种于机油浓度为1.0g/L的MSM培养基，振荡培养7d，用正己烷萃取并溶解培养液中的机油残油组分进行GC-MS分析，结果见图3-9，对于原油和菌株降解后饱和烃组分分析见表3-13。48 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究图3-9菌株降解机油的GC-MS结果分析Fig.3-9AnalysisofGC-MSresultsofoildegradationbystrains49 陕西理工大学硕士学位论文表3-13菌株作用后的饱和烃组分分析Table3-13GasChromatogramanalysisofsaturatedhydrocarbons色谱峰面积饱和烃碳数空白（CK）JZ6JZ18JZ41JZ50C101.251.600.650.61C111.381.770.720.68C123.444.401.791.69C133.444.401.791.69C142.192.801.141.070.83C155.997.673.112.942.28C166.642.123.453.252.52C1710.663.415.545.224.05C188.782.814.574.303.34C1929.689.5015.4314.5411.28C2034.2210.9517.7916.7713.00C2116.975.438.828.326.45C2243.5513.9422.6521.3416.55C2358.7118.7930.5328.7722.31C2478.6825.1840.9138.5529.90C2532.5710.4216.9415.9612.38C2648.6515.5725.3023.8418.49C2798.3331.4751.1348.1837.37C2881.6026.1142.4339.9831.01C29127.0940.6766.0962.2748.29C30151.3448.4378.7074.1657.51C31109.2334.9556.8053.5241.51C32117.0937.4760.8957.3744.49C33161.7851.7784.1379.2761.48C34120.1738.4562.4958.8845.6650 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究表3-13菌株作用后的饱和烃组分分析（续）Table3-13GasChromatogramanalysisofsaturatedhydrocarbons(Continued)色谱峰面积饱和烃碳数空白（CK）JZ6JZ18JZ41JZ50C35384.24122.96199.80188.28146.01C3696.7250.2947.3936.75C3727.9414.5313.6910.62C3817.879.298.766.79C3911.085.765.434.21C401.250.650.610.48Total1892.53573.04984.12927.34715.55GC-MS分析机油残油组分，发现原油主要组分为直链烷烃，其次为支链烷烃、环烷烃，以及一定量的芳香烃和非烃类物质，其中的直链烷烃主要为正十二烷、二十烷、二十三烷、二十四烷、二十六烷、二十七烷、三十一烷、三十三烷和三十六烷，烷烃占原油总量59.89%.菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50对总烷烃的降解率分别达到69.72%、48.00%、51.00%和62.20%，对直链烷烃的降解率分别为86.89%、55.98%、58.42%和89.13%，表明4株菌对烷烃具有很强的降解效果，其中菌株JZ6对于C35~C40的长链烷烃降解效果明显，能够完全降解C36~C40的长链烷烃，菌株JZ50能够完全降解C10~C13的短链烷烃，菌株JZ6和JZ50对除烷烃类的其他芳香烃类物质也有一定的降解作用。3.4小结与讨论本章是利用紫外分光光度仪对初筛的36株机油降解菌进行机油降解率的测定，进而筛选出4株机油高效降解菌株，菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50，在含原油培养基中30℃培养7d后，石油降解率分别为42.16%，33.94%，33.75%和41.89%。在研究4株机油高效降解菌株的降解能力及特性结果中发现：在温度20~40℃，pH5~9条件下菌株都具有降解机油的能力，4株菌株均能以十二烷，十六烷，十八烷，苯和萘为唯一碳源生长，JZ6和JZ50还能在含芘和菲的培养基中生长。GC-MS分析机油残油组分，发现原油主要组分为直链烷烃，其次为支链烷烃、环烷烃，以及一定量的芳香烃和非烃类物质，其中的直链烷烃51 陕西理工大学硕士学位论文主要为正十二烷、二十烷、二十三烷、二十四烷、二十六烷、二十七烷、三十一烷、三十三烷和三十六烷，烷烃占原油总量59.89%。菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50对总烷烃的降解率分别达到69.72%、48.00%、51.00%和62.20%，对直链烷烃的降解率分别为86.89%、55.98%、58.42%和89.13%，表明4株菌对烷烃具有很强的降解效果，其中菌株JZ6和JZ50对除烷烃的其他芳香烃类物质也具有一定的降解作用。本研究结果可丰富机油降解菌菌种资源库且为更好地利用微生物治理机油污染环境提供理论依据。在研究培养时间对菌株降解能力影响实验中，培养第9d时，菌株JZ6，JZ18，JZ41，JZ50机油降解率分别达到44.50%，34.57%，35.33%，40.20%。菌株JZ6，JZ50在1~5d机油降解率增长较快，第5d后，机油降率增长较平缓，处于较稳定状态，菌株JZ18，JZ41在第7d机油降率增长较平缓，处于较稳定状态。该结果表明不同菌株最佳降解时间不一致，菌株培养时间要控制在一定范围（5~7d），菌株机油降解率不仅能够达到最好效果，且株菌投入生产时，时间短，效益高。在研究培养温度对菌株降解能力影响实验中，菌株JZ6在培养温度为35℃时，菌株机油降解率达到最高43.01%，菌株JZ18，JZ41和菌株JZ50在培养温度为30℃时，菌株机油降解率达到最高，分别为32.74%，32.48%，38.94%。该结果表明菌株培养温度要控制在一定范围内（30℃~35℃），机油降解率才能达到最好效果。并且由于土样最初富集培养的温度为30℃，所以4株菌株在30℃时都有较好的机油降解效果。在研究培养基初始pH对菌株降解能力影响实验中，菌株JZ6、JZ18、JZ50的机油降解率在培养基初始pH7.5时达到最大，分别为42.12%，34.73%，41.18%，菌株JZ41机油降解率在pH7.0时达到最大值34.04%，此外偏弱酸性或弱碱性的环境均不利于菌株的机油降解，要控制培养基的初始pH在7.0~7.5之间。碳、氮源添加最佳条件下，JZ6的最高降解率为60.63%，JZ18的最高降解率为53.28%，JZ41的最高降解率为52.19%，JZ50的最高降解率为53.54%。从原油初始浓度对机油降解率的实验结果中可以看出，随着原油初始浓度的增加，机油降解率逐渐降低，较高的机油浓度对微生物降解机油起到一定的抑制作用，原因可能是以机油作为微生物生长所需的唯一碳源，当浓度过高时，对微生物起到了一定的毒害作用，影响或抑制其生长，从而影响了机油降解反应得速度，严重时甚至可时微生物无法降解，造成生物修复的不可进行。52 第3章高效机油降解菌的筛选及其降解特性的研究在探究微生物降解机油的特性方面，国内外学者都做过很多研究，Quatrini[119]等研究者分离出几株红球菌属，能降解直链烷烃类物质，但不能降解苯、菲等芳香烃类物质。本文分离所得的4株机油高效降解菌中，4株菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50均能够较好的利用直链类烷烃，但对于苯、萘、芘和菲这类芳香烃类化合物的降解效果有所差异。Soudi[120]等分离出一株对直链烷烃降解效果不明显但对苯酚类物质具有高效降解的菌株，培养24h，可将含苯酚1.0g/L的培养基中苯酚降解99%以上。Lin等[121]对菌株PseudomonaP29的研究结果表明，菌株P29对短链烷烃有很好的降解效果，而本研究所筛选菌株JZ18对长链烷烃也有很好的降解效果。与孙华庆等[91]研究结果相比，本研究所筛得的菌株JZ50除能降解吡啶外，还能以十二烷，十六烷，十八烷，芘，菲，苯和萘为唯一碳源生长。有关Massilia属的降解菌中，罗小艳等[71]对多环芳烃中菲具有很好的降解作用，48h菲的降解率达96.78%，而本研究所筛选菌株JZ6对多环芳烃中芘，菲，苯和萘都具有一定降解作用。53 陕西理工大学硕士学位论文54 第4章全文结论第4章全文结论本文从长期受各种机油类物质污染的汉中某工具厂污水处理车间采集了活性污泥、污水沟、活性污泥带沙3种不同机油污染样品，经过富集驯化后，分离出36株机油降解菌，对所得的36株机油降解菌株进行鉴定，确定其属种及在细菌分类系统中的地位。利用紫外分光光度法测定初步筛选出的36株机油降解菌的机油降解率，筛选出4株机油高效降解菌，分别为菌株JZ6，JZ18，JZ41和JZ50，并且研究了不同培养时间、pH、温度、原油初始浓度、辅助碳源和辅助氮源6个因素对4株机油高效降解菌降解率的影响。将4株机油高效降解菌进行任意组合构成复合菌群，利用紫外分光光度法测定各菌群机油降解率，筛选出其中降解率最高的一个复合菌群K。将4株机油高效降解菌株在含十二烷、十六烷、十八烷、二十二烷、苯、萘、芘和菲的不同有机物组分中培养，观察4株机油高效降解菌株在不同有机物组分中的生长特性。用GC-MS方法对4株机油降解菌作用后的残油组分进行分析，研究4株机油高效降解菌的主要降解组分。通过以上研究，得出的主要研究结果如下：（1）经过连续3个周期连续15d的富集培养，从汉中某工具厂污水处理车间共分离筛选出36株机油降解菌，对36株机油降解菌株进行鉴定，结果为菌株JZ2、JZ3和JZ4为Dyadobacter；菌株JZ6为Massilia；菌株JZ7为Arthrobacter（节细菌属）；菌株JZ8、JZ9、JZ10、JZ11和JZ26为Acidovorax（食酸菌属）；JZ12和JZ18为Pseudomonas(假单胞菌属)；菌株JZ13、JZ14、JZ15、JZ21、JZ22、JZ23、JZ24、JZ27和JZ28为Ochrobactrum（苍白杆菌属）；JZ17为Hydrogenophaga（氢噬胞菌属）；菌株JZ30、JZ43和JZ44为Perlucidibaca；菌株JZ36为Rhodobacter（红杆菌属）；菌株JZ32、JZ34和JZ37为Stenotrophomonas（嗜麦芽窄食单胞菌）；JZ39和JZ41为Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）；JZ45和JZ49为Paracoccus（副球菌属）；JZ47和JZ48为Catellibacterium；菌株JZ50为Shinellazoogloeoides。（2）用紫外分光光度计测定机油含量以吸光度值（y）为纵坐标，以机油标准溶液为横坐标，得出方程y=0.0187x-0.0061，由方程式计算各菌株机油降解率。筛选出4株机油高效降解菌株，分别为菌株JZ6，JZ18，JZ41和JZ50。其中菌株55 陕西理工大学硕士学位论文JZ6在相同培养时间内降解率达到最高，为42.16%，其次为菌株JZ50，降解率为41.89%，再其次为JZ18，降解率为33.94%，最后为JZ41，降解率为33.75%。（3）研究了不同培养时间、pH、温度、原油初始浓度、辅助碳源和辅助氮源6个因素对4株机油高效降解菌降解率的影响。结果表明在培养时间上，在一定培养时间内，培养时间越长，机油降解率越高，机油降解率随培养时间的增加趋近于平缓，为了经济效益等多方面考虑，最适培养时间为5~7d。在培养温度上，20℃~40℃范围内，机油降解菌均能降解机油，最适温度为30℃~35℃，在此温度范围内，4株机油降解菌的降解效果均较好。在培养基初始pH上，pH在5.0~9.0范围内机油降解菌均能降解机油，pH在7.0~7.5之间4株机油降解菌的降解效果均较好。碳、氮源添加最佳条件下，JZ6的最高降解率为60.63%，JZ18的最高降解率为53.28%，JZ41的最高降解率为52.19%，JZ50的最高降解率为53.54%。（4）将4株机油高效降解菌进行任意组合构成复合菌群，在同样的培养条件温度30℃培养7d，比较各组合菌群的机油降解率，其中大多数菌群的机油降解率比单菌株的降解率均有提高。由菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50组合形成的复合菌群K机油降解率达到最高，为66.87%，确定其为最佳组合。（5）4株机油高效降解菌JZ6、JZ18、JZ41和JZ50均能够较好的利用直链类烷烃，但对于苯、萘、芘和菲这类芳香烃类化合物的降解效果有所差异，JZ6和JZ50在苯、萘、芘和菲的培养基中均能促进生长，但菌株JZ18和JZ41在芘和菲的培养基中抑制了生长。GC-MS结果分析表明4株菌株对短链、中长链和长链等烷烃类都具有较好的降解作用，菌株JZ6、JZ18、JZ41和JZ50对总烷烃的降解率分别达到69.72%、48.00%、51.00%和62.20%，菌株JZ6和JZ50对于其他的芳香烃类物质也具有一定的降解作用。56 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陕西理工大学硕士学位论文[102]GiuseppeGF,Leite,JucianeVF,etal.Productionofrhamnolipidsanddieseloildegradationbybacteriaisolatedfromsoilcontaminatedbypetroleum[J].BiotechnologyProgress,2016,32(2).[103]ChanTian,ShengyanTian,XianbinLiu,LuluQin.Isolation,IdentificationandDegradationCharacteristicsofThreeThickOilDegradingBacteriaStrains[M].SpringerBerlinHeidelberg:2014-06-15.[104]M.B.Gomes,E.E.Gonzales-Limache,S.T.P.Sousa,etal.Exploringthepotentialofhalophilicbacteriafromoilterminalenvironmentsforbiosurfactantproductionandhydrocarbondegradationunderhigh-salinityconditions[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2016.[105]ChiaWP,NurFAB,AinonH.AComparativeStudyonBiosurfactantActivityofCrudeOil–DegradingBacteriaandItsCorrelationtoTotalPetroleumHydrocarbonDegradation[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2013,17(4).[106]EGonzales-Limache,S.T.P.Sousa,etal.Exploringthepotentialofhalophilicbacteriafromoilterminalenvironmentsforbiosurfactantproductionandhydrocarbondegradationunderhigh-salinityconditions[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2016.[107]李雁峰.复合功能菌群的构建及其对铅锌胁迫下蓖麻种子萌发的影响[D].长沙:中南林业科技大学,2017.[108]何江,毛忠贵,张庆华等.高效木薯渣分解复合菌群RXS的构建及其发酵特性研究[J].环境科学,2012,33(03):1020-1027.[109]李玉琦.高效降解水稻秸秆复合菌群的构建及其降解效能[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2016.[110]赵听.小麦秸秆降解复合菌群FWD1的构建、降解特性及其微生物群落组成研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2015.[111]杨智,陈吉祥,秦波,等.3株石油降解红球菌(Rhodococcusspp)特性及相关基因分析[J].应用与环境生物学报,2015,21(05):805-812.[112]邸富荣.渤海石油烃降解菌的分离鉴定及基因组学分析[D].天津:天津科技大学,2017.[113]田苗.石油降解菌的筛选及对石油污染土壤的修复实验[D].西安:西北大学,2010.64 参考文献[114]孙晶.天津海域石油降解细菌的分离鉴定及其主要降解途径的研究[D].天津:天津科技大学,2016.[115]李政.耐热石油降解混合菌群降解特性及多环芳烃共代谢作用的研究[D].青岛:中国石油大学,2012.[116]郝婧,高磊,吴春旭,等.石油降解菌PseudomonasstutzeriTH-31的分离与降解条件优化[J].环境工程学报,2015,9(04):1771-1777.[117]KuiperI,LagendijkeL,BloembergV,etal.Rhizoremedi-ation:abeneficialplant-microbeinteraction[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2004,17(1):6-14．[118]CappelloS,SantisiS,CalogeroR,etal.Characterisationofoil-degradingbacteriaisolatedWater[J].Air,&SoilPollution,2012,223(6):3219-3226.[119]QuatriniP,ScaglioneG,DePasqualeC,etal.IsolationofGram-positiven-alkanedegradersfromahydrocarbon-contaminatedMediterraneanshoreline[J].ApplMicrobiol,2008,104(1):251-259.[120]SoudiMR,KolahchiN.Bioremediationpotentialofaphenoldegradingbacterium,RhodococcuserythropolisSKO-1[J].ProgBiolSci,2011,1(1):31-40.[121]LinX,YangB,ShenJ,etal.BiodegradationofcrudeoilbyanArcticpsychrotrophicbacteriumSeudoalteromomassp.P29[J].CurrMicrobiol,2009,5(3):341-345.65 陕西理工大学硕士学位论文攻读硕士学位期间学术成果一、研究生期间公开发表的论文及专利1.黄曼曼,邓百万,解修超,等.秦岭地区野生细鳞鲑肠道微生物多样性及产酶活性分析[J].动物学杂志,2018,53(01):114-125.2.黄曼曼,邓百万,王梦姣,等.机油高效降解菌的筛选鉴定及降解特性的初步研究[J].生物技术通报:1-8[2018-03-22](网络版).3.黄曼曼,乔帅,王梦姣,等.香菇胞外多糖高产菌株的紫外诱变选育[J].江苏农业科学,2017,45(13):222-225.4.黄曼曼,邓百万,武晓雨,等.石油污染土壤的微生物修复技术研究进展[J].黑龙江农业科学,2017(04):149-153.二、获得奖项1.获得2017年陕西理工大学研究生校级二等奖学金；2.获得2016年陕西理工大学研究生校级三等奖学金；三、参加的科研项目与活动1.主持参与校级创新基金项目“秦岭细鳞鲑鱼肠道微生物多样性及产酶活性研究”，项目号为SLGYCX1722。2.参与校级创新基金项目“安康地区不同品系水稻根际微生物物种多样性分析研究”，项目号为SLGYCX1618。66 致谢致谢时光荏苒，岁月匆匆，转眼间三年的研究生生活即将结束，曾幻想过无数次写硕士论文最后一部分致谢部分时会是怎样的心情，竟是这般的宁静、不舍和感慨。很庆幸自己能有这样的机遇成为陕西理工大学的学子，让我感受到了坐落于小江南的陕理工春夏秋冬不一样的美，浓浓的书香氛围以及淳朴上进的学风。回想起三年的求学经历，感慨良多，对那些曾经引导我、帮助我、鼓励我的人和事心中充满感激。首先谢谢我的导师邓百万教授，三年来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力以及宽厚的胸怀都是学生一生的学习榜样。从第一次学着写论文、发表论文到毕业论文的选题、撰写、一次又一次的修改，直至定稿的完成，无不倾注了导师大量的心血与智慧。导师在授我以文的同时更教我如何做人做学问，虽历时三载，却赋予我终生受益无穷之道。其次感谢在我实验过程中一直指导我、帮助我的王梦姣老师，感谢陈文强老师、解修超老师、刘开辉老师、兰阿峰老师、彭浩老师和丁小维老师，微生物组的全体老师们对我实验学习过程中以及论文撰写过程中提供的帮助与支持，向您们致以崇高的敬意和由衷的感谢！祝愿您们万事如意，桃李满天下！感谢杨海旭师兄、虞小燕师姐和乔帅师姐对我在学习、实验和生活上的帮助，感谢武晓雨、李艳丽和姜午春等同级同学兼好友对我的帮助和支持，感谢罗阳兰、毛仪楠和刘军生等师妹师弟们对我的帮助和信任。感谢好友罗敏在各个时刻各个方面对我的帮助，感谢1002宿舍的舍友们，祝愿你们心想事成，学业有成！特别感谢我的家人对我学习的理解、支持和关心，他们是我永远前进的不竭动力！最后要感谢百忙之中为本论文进行审阅和答辩的各位专家教授，祝各位专家教授工作顺利，幸福安康。67
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