大叶千斤拔与蔓性千斤拔的高效液相色谱指纹图谱鉴别

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1、大叶千斤拔与蔓性千斤拔的高效液相色谱指纹图谱鉴别【摘要】目的鉴别大叶千斤拔、蔓性千斤拔。方法采用HPLC法，KrosmasilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，乙腈-水梯度洗脱，检测波长为274nm，流速为1ml/min，柱温为30℃。结果在选定色谱条件下，建立了稳定可控的高效液相色谱图;应用主成分分析法、系统聚类分析法将药材分成两类，并计算相似度。结论应用高效液相色谱法鉴别大叶千斤拔、蔓性千斤拔是可行的。【关键词】高效液相色谱指纹图谱法;大叶千斤拔;蔓性千斤拔;系统聚类法;主成分分析　Abstract：ObjectiveToidentifyMoghaniamacrop

2、hylla(oghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li.MethodsThefingerprintsoghaniamacrophylla(oghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li..　　Keyacrophylla(oghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li.;Clusteringanalysis;Principalponentsanalysis　　《中国药典》2005版Ⅰ部中收载千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔M.ghaniaphilippinensis(Merr.etRolfe)Li，大

3、叶千斤拔M.ghaniamacrophylla(oghaniaferruginea(poasilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱,梯度洗脱程序表见表2，检测波长274nm;流速1ml/min，柱温30℃;进样量10μl;所有组分均在110min内被检测完。　　2.2样品溶液的制备取以上各样品(过40目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，放置12h，超声处理(功率250in，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。表2梯度洗脱程序　　2.3方法学考察　　2

4、.3.1运行时间考察了样品2.5h的色谱记录图，发现110min后无色谱峰出现，因此确定样品运行时间为110min。　　2.3.2精密度、重复性与稳定性取12号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)，按上述样品溶液制备方法制备供试液，按上述色谱条件重复进样5次，记录色谱图，以中国药典委员会主持开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行相似度评价，结果相似度均大于0.99，说明仪器精密度良好;另取12号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)5份，分别按上述样品溶液制备方法制备供试液，按上述色谱条件进样，记录色谱图，用相似度评价软件评价相似度，结果相似度均大于0.99，说明方法重复性良

5、好;取12号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)，按上述样品溶液制备方法制备供试液，分别于0，4，8，16，24，48h进样，记录色谱图，用相似度评价软件评价相似度，结果相似度均大于0.99，说明样品48h内稳定。　　2.4指纹图谱分析　　2.4.1样品测定取以上各样品粉末,按样品溶液的制备方法制备供试液,按上述色谱条件进样。色谱图见图1(a)。图112批样品与对照品的叠加图(a)和不同波长色谱图(b)比较　　2.4.2峰信息的提取在选择量化指标(色谱峰数目)时，以“对分类决策有影响的信息应尽量保留，对分类决策无影响的信息应尽量舍弃”的原则筛选了24个色谱峰，以峰面积归一化法计算

6、的每个峰的面积百分比作为HPLC数量化特征。　　2.4.3相似度评价用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对12批样品进行相似度评价。结果见表3。　　2.5主成分分析应用DPSv2.00统计软件对取得的HPLC数量化特征进行主成分分析，前3个主成分的累计贡献率大于80%，主成分分析见图2(a)。　　2.6系统聚类分析应用DPSv2.00统计软件对取得的HPLC数量化特征以及12批样品的主成分得分进行系统聚类分析(组间距离法,欧氏距离)。结果见图2(b)和2(c)。图2主成分分析图(a)、聚类分析图(b)和主成分得分的聚类分析图(c)表312批样品的相似度计算结果　　3讨论　　实验曾

7、考察了氯仿、醋酸乙酯、甲醇为提取溶媒进行提取，考察了冷浸提取、超声提取、冷浸后超声提取等方法，最后确定用甲醇冷浸后超声提取30min效果最好，且方法简便。　　色谱条件的优化在色谱条件优化过程中，流动相分别比较了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水，最后选择了乙腈-水进行梯度洗脱，因千斤拔组分k'分布区域较广，因此采用曲线梯度洗脱。柱温分别考察了25，30，35℃，流速分别考察了0.8，1，1.2ml/min，最后发现柱温、流速对色谱行为影响不大，综合考虑,最后选择柱温为30℃，流速为