braf基因突变检测在甲状腺乳头状病变中的临床意义

《braf基因突变检测在甲状腺乳头状病变中的临床意义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、BRAF基因突变检测在甲状腺乳头状病变中的临床意义张翼1李惠2陈劼2张士虎11.江苏省中医院急诊外科，江苏南京210029；2.江苏省中医院病理科，江苏南京210029[摘要]目的探讨BRAF基因在甲状腺乳头状病变中的突变情况及临床意义。方法提取石蜡肿瘤组织中DNA，采用直接测序法分析24例甲状腺乳头状癌和30例甲状腺不典型乳头状腺瘤石蜡组织中BRAF基因突变的情况。结合临床资料进一步分析。结果24例甲状腺乳头状癌，16例发现BRAF基因15外显子第600位密码子A/T杂合（V600E），突变率为66.7%（16

2、/24）。而30例甲状腺不典型腺瘤中未发现V600E病理性突变（0/30）。结论BRAFV600E位点突变仅见于甲状腺乳头状癌，具有一定的特异性，可以用于帮助临床甲状腺乳头状增生良恶性的鉴别。.jyqk厚石蜡白片，脱蜡消化后提取DNA。具体方法见试剂盒说明书（OmegaFFPEDNAKit，USA）。以凝胶电泳系统检测DNA模板的质量。1.2.2PCR扩增使用ABI-2700型测序级扩增仪，扩增目的基因片段。反应体系：10×PCRBuffer2μL，HotStarTaqDNAPolymerase0.25μL(QI

3、AGEN，USA)，5×Q-Solution4μL,dNTP2μL,Primer各1μL,模板DNA1μL,去离子水8.75μL。95℃10min;94℃50s,57℃1min,72℃1min,共循环35次,最后于72℃延伸10min。PCR产物纯化具体方法见试剂盒说明书（AXYPrepPCRCleanupKit,USA）。1.2.3测序测序方法[5]：在3100-Avant遗传分析仪进行测序;Datacollection软件自动进行数据处理和分析。对于测序中发现有突变的病例,都进行反向测序验证。将测序结果用DN

4、Asequencinganalysis5.1软件分析原始测序数据,获取测序电泳图和序列。将样品序列用ABISeqScape软件与genebank标准序列进行比对,观察样本基因序列的改变。1.3统计方法数据处理使用SPSS13.0软件。计数资料采用χ2检验、Fisher’s确切概率法进行显著性检验。2结果经直接测序法测定，54例样本成功检测了BRAF第15外显子突变情况，突变位点全部位于V600E位点，未发现其他类型突变。24例甲状腺乳头状癌，16例发现BRAF基因15外显子第600位密码子A/T杂合（V600E）

5、，突变率为66.7%（16/24）。而30例甲状腺不典型腺瘤样本中未发现V600E位点病理性突变（0/30）,两者差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。研究结果还显示，BRAFV600E突变与性别、年龄、肿瘤大小无关，差异无统计学意义（P>0.05），与组织学类型相关。见表2。3讨论甲状腺乳头状癌组织光镜下多表现为乳头状，细胞核毛玻璃样，可观察到核沟，核内包涵体，间质中含有砂粒体，此为重要的特征。而当乳头由于冰冻处理或者其他原因造成不典型时与腺瘤难以鉴别。免疫组化可以用于鉴别诊断，但是免疫组化操作

6、过程中易出现假阴性或者假阳性，人工判读结果也有一定的主观性，易造成误诊。两者治疗和预后差别很大，需要一个客观的检测指标。BRAF基因为RAF家族成员，位于7号染色体，是编码B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶的激酶。研究显示，BRAF基因第15位外显子上的T1799A点突变（V600E）导致BRAF中的缬氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，进而持续激活BRAF激酶，造成MAPK通路持续活化，细胞不断分裂、增殖，进而形成肿瘤[6]。在转基因小鼠中通过BRAF突变的表达，可诱导出乳头状癌，表明了BRAF基因在乳头状癌起始

7、中的重要作用[7]。Fukushima等[8]检测了100例甲状腺癌的BRAF基因突变情况，发现BRAF基因的突变仅存在甲状腺乳头状癌中，而且仅发现了V600E突变,阳性率为53％(40/76).多项研究[9-11]显示甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变率为29%~87%，而滤泡型腺癌和所有良性病变如单纯性甲状腺肿则无此突变。Zhang[11]等发现在甲状腺细针穿刺标本中71.4%发生BRAFV600E突变，所有BRAF(V600E)阳性的标本甲状腺切除术后都被证实为甲状腺乳头状癌。最近的研究还显示，BRAF（V6

8、00E）突变的发生率有地区差异。例如，BRAFV600E突变率在韩国（52％~87％）比其他国家（36％~65％）高[3]。造成这种差异的原因尚不清楚，可能是由于地理因素。一些研究报道了在高碘摄入区BRAFV600E突变率更高，这可能表明碘过量摄入是乳头状癌BRAFV600E突变的一个危险因素[12]。甲状腺乳头状癌的预后较好，十年生存率超过90%。但是35%的患者在长期