hplc法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量

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1、HPLC法测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量【摘要】目的建立测定红曲霉发酵液中洛伐他汀含量的方法。方法采用HPLC法，以甲醇作溶剂、摇床振荡（150r/min）3h提取洛伐他汀，色谱条件：以甲醇18mmol/L磷酸溶液（体积比为80∶20）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为237nm。结果洛伐他汀在5～50μg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好，加样平均回收率为100.75%，RSD为0.87%。结论本方法简便有效，重复性好，可作为红曲霉相关产品的质量控制方法。【关键词】高效液相色谱法；红曲霉；洛伐他汀　　Abstract:ObjectiveToesta

2、blishanHPLCmethodfordeterminingthecontentoflovastatininfermentationbrothofMonascus.MethodLovastatincouldbepletelyextractedfromthefermentationbrothbymethanolundershakingfor3hin.Then,samplesnusingmethanol18mmol/Lphasphate(80∶20)asmobilephaseunderthefloL/min.Thedetection.ResultThemethodhad

3、goodlinearityovertheconcentrationof5～50μg/mLforlovastatin.Theaveragerecoveryethodisconvenient,effectiveandaccurate,pooR低温高速离心机（德国Sorvall公司），SHZ-82气浴恒温振荡器（江苏省金坛市宏华仪器厂），十万分之一电子天平（日本岛津）。　　1.2试剂与试药　　洛伐他汀对照品（批号100600-200502，中国药品生物制品检定所），95%乙醇（分析纯，广州化学试剂厂），甲醇（分析纯，广州化学试剂厂），甲醇（色谱纯，英国TEDIA公司）。　　1

4、.3菌株　　安卡红曲霉（Monascusanka）CICC5031，由中国工业微生物菌种保藏中心保存。　　2菌株的培养　　将菌株接种在含有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）4.01%的平板培养基上培养5d，以活化菌株，然后接种于含有质量分数分别为葡萄糖10%，牛肉浸膏0.5%，（NH4）2SO42.5%，番茄酱5%，CaCO31%，MgSO4·7H2O1%，pH6.5的摇瓶培养基，30℃、150r/min振荡培养。　　3方法与结果　　3.1色谱条件色谱柱为DikmaDiamonsilC18(4.6mm×250mm；5μm)；柱温30℃；检测波长237nm；进样体积10μL，甲醇

5、18mmol/L磷酸（体积比80∶20）为流动相，流速为1.0mL/min。在该条件下，对照品与样品的色谱图见图1。　　3.2标准曲线的绘制　　样品溶液的制备：取摇瓶培养10d的发酵液2mL,研磨后加入8mL无水甲醇，150r/min振荡3h，5000r/min离心10min后取上清，经0.22μm滤膜过滤后得到样品溶液。　　　　对照品溶液的制备：准确称取洛伐他汀对照品10.0mg，用无水甲醇定容至100mL，经0.22μm滤膜过滤后得到100μg/mL对照品溶液。　　　　取上述对照品溶液稀释得到5，10，20，30，40，50μg/mL的系列溶液，按照所述色谱条件进

6、样，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归,回归方程为A=44813ρ-1330.6，R2=1.0000,洛伐他汀在5～50μg/mL范围内线性关系良好。　　3.3精密度试验　　　　取50μg/mL对照品溶液，按上述液相色谱条件，进样测定5次，结果峰面积的RSD值为0.56%，表明方法精密度良好。　　3.4重复性试验　　　　取同批样品溶液5份，按“3．2”项方法制备，进样测定，结果洛伐他汀平均含量的RSD值为0.82%，表明方法重复性好。　　3.5稳定性试验　　取重复性试验中同一浓度样品溶液室温下放置，于第0、2、4、8、12h依次测定洛伐他汀含量，结果其RSD值为

7、0.67%，表明样品溶液在12h内测定结果稳定。　　3.6回收率试验　　　　精密量取1mL样品溶液，置25mL容量瓶中，分别精密加入50μg/mL的对照品溶液0.6、0.8、1.0mL，加无水甲醇稀释到刻度，在所述的色谱条件下测定。计算回收率，结果见表1。表1洛伐他汀回收率试验结果（略）　　4讨论　　　　红曲霉中洛伐他汀提取溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯等。本文尝试用不同溶剂及不同时间进行洛伐他汀提取，结果表明,用无水甲醇提取3h的提取效果较好。　　在实验中发现，新配制的洛伐他汀对照品溶液只有一个吸收峰，是酯式的洛伐他汀。但放置2d后，由于洛