thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

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1、Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化作者：顾林，文良柱，吴国球，徐寒梅，沈子龙【摘要】目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体（ThT）蛋白并纯化。方法:PCR合成ThT基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建ThT原核表达载体（pET32aThT）并转化到大肠杆菌BL21融合表达，通过正交实验优化表达条件，HisBind介质纯化。考察经酶切纯化后的重组ThT对4种供试菌的最低抑制浓度。结果:菌体在LB培养基（pH65）培养4.5h，IPTG0.4mmol·L－1诱导7

2、h，ThT融合蛋白大量可溶性表达，经药敏试验证明纯化的重组ThT具有预期的抗菌活性。结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组ThT抗菌药物奠定了基础。【关键词】thanatin；突变体；大肠杆菌；融合蛋白；纯化；表达；药敏试验　Thanatin是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisusmaculiventris）中发现的，由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽，对革兰阳性、阴性菌以及某些真菌均有抑制作用，而且对一些临床上的耐药菌也有良好的抗菌活性[1]。Lee等[2]研究了thanatin的各种突变体，发现将其结构中第15位的苏氨酸残基删

3、除后，对革兰阳性菌的抑制效果增强，而对革兰阴性菌和真菌的最小抑菌浓度不变，其二级结构仍保持thanatin原有的结构，即N末端7个氨基酸臂和C末端的14个氨基酸组成的β片层结构,通过抑制细胞呼吸达到抗菌的效果[3]。目前国内外对thanatin已有深入的研究[45]，而对具有更佳抗菌效果的突变体相关研究却比较少。本研究旨在将人工合成的thanatin突变体（ThT）基因克隆到pET32a融合表达载体中，通过正交设计考察培养基pH值、诱导剂用量及诱导时间与融合蛋白表达水平的关系，使融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效可溶性

4、表达，纯化融合蛋白并经凝血酶切割，考察纯化的重组ThT作为抗菌药物的应用价值。　　1材料与方法　　1.1菌种和载体大肠杆菌菌株BL21(DE3)和pET32a载体由第一作者所在实验室保存，标准菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌由中国药科大学微生物学教研室提供。　　1.2酶和试剂限制性内切酶、Taq酶、dNTPs、DNAmarker、异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为MBI产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，丙烯酰胺、亚甲基双丙烯胺及Tris碱为BBI产品，低分子质量蛋白质标准品为Prome

5、ga公司产品；HisBindResin为Novagen公司产品，Thrombin及其10倍缓冲液为Sigma公司产品，结合缓冲液、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液按NovagenHisBindResin试剂盒配制，其余试剂为进口分装产品。　　1.2方法　　1.2.1ThT基因的合成与表达载体pET32aThT制备及转化　　1.2.1.1ThT基因的合成根据ThT基因的氨基酸序列GSKKPVPIIYRRGKCQRM和大肠杆菌的偏爱密码子逆推出突变体的cDNA序列，并设计出PCR的引物。引物1：CGCTCGAGTTACATACGC

6、TGGCACTTACCCCTACGGTTACAGTAGATTATC;引物2：GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCCTGTCCCGATAATCAACTGTAAC。单下划线序列为限制性内切酶切位点，双下划线为编码凝血酶酶切位点的序列。引物1和2互为模板，PCR扩增基因。PCR反应体系（50μl）：引物浓度2μmol·L-1，dNTPs40μmol·L-1，MgCl21μmol·L-1，Taq酶0.5U，PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min。　

7、　1.2.1.2表达载体pET32aThT构建PCR产物经纯化后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切得到的片断由BamHⅠ和XhoⅠ位点克隆到载体pET32a，转化到大肠杆菌BL21菌株，涂布含氨苄青霉素100mg·L-1的LB平板，37℃培养过夜，挑选克隆培养提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ单酶切验证，进一步测序确定（由上海生工生物工程有限公司完成）。　　1.2.2融合蛋白可溶性表达的条件优化将测序正确的阳性菌株转入含氨苄青霉素100mg·L-1的LB培养液，37℃培养过夜。挑选1个单克隆菌落，转入含氨苄青霉素100μg·ml-

8、1的LB培养液，37℃培养过夜作为种子液，取适量菌液。按1％的接种量放大培养，在摇瓶条件下摸索融合蛋白表达的最佳条件。正交设计在单因素考察的基础上，取4因素（培养基pH值、诱导剂用量、加诱导剂前的培养时间、诱导时间）各4水平按L16（45）进行正交