人era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

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时间:2018-11-24

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1、人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化作者:吴元明,陈苏民,陈南春,纪宗玲,刘惠萍,张俊杰【关键词】人Era基因  关键词:人Era基因;基因表达;蛋白纯化  摘要:目的在大肠杆菌中对人的era基因(简称hera)进行表达、纯化.方法PCR扩增hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C,重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,用IPTG进行诱导表达.然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化.结果克隆了hera基因,测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因,表达量占细菌总蛋白的59.6%.融合

2、蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在,在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白,其纯度达到了98.0%.结论利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因.并对融合蛋白进行了初步纯化.   KeyanEragene;geneexpression;protEinpurifi-cation  Abstract:AIMToexpresshumanEraprotEIninE.coliandpurifyitpreliminarily.METHODSAfterbeingamplifiedbyPCRandidentifiedbysequencingthehumanerageneidpRSE

3、TC-heraedintoBL21(DE3)and inducedotography.RESULTSThehumanerageneplifiedandthesequenceprovedtobecorrect.Thehera-cDNAgenehadbeenclonedintothevectorandex-pressedinE.coli,andtheexpressedproteintook59.6%ofthetotalbacterialprotein.Thefusedproteinexistedinthepatternofinclusionbody,anditotographycolum

4、n.CONCLUSIONTheheragenecouldbeexpressedinarily.  0引言  era基因是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时,在编码RNaseIII的rnc基因下游发现的一个开放读框,因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处,命名为E.coliRas-like(era)基因[1].era基因在原核生物中普遍存在,在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成员.它由两个结构域组成:N端是一个典型的GTPase结构域;C端结构域为Era所特有,其中含有一个KH结构域[2].在大肠杆菌中e

5、ra基因和rnc基因同属于rnc操纵元,rnc基因和era基因的表达共同受RNaseIII的负调控[3].era是大肠杆菌中可以正常表达的基因,但表达水平极低.遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关,是细菌生存繁殖所必需的重要基因[4].高表达的细菌Era蛋白有GTP结合及GTPase活性[5].最近发现细菌Era蛋白可以特异地与16S-rRNA结合[6].  本室陈苏民教授通过计算机寻索,发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era同源的EST序列,并且相继克隆了人及小鼠全长的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全长约2.2kb,含长度为1038bp的开放读框,编码346

6、氨基酸的蛋白质[7].人Era(hEra)与大肠杆菌Era(eEra)蛋白全序列比较,有31.0%相同、53.0%相似.同样,hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成[8].新近克隆的人及小鼠era基因为整个era基因家族的功能研究提供了重要的资料.本研究目的是将hera基因在大肠杆菌中进行高表达、纯化.这为进一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基础.  1材料和方法  1.1材料  大肠杆菌BL21(DE3)菌种购自Promega公司.pUC19质粒均为本教研室保存;表达质粒pRSET-C为Invitrogen公司产品.pBS-hera为陈苏民教授提供.各种限

7、制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为Gibco公司产品.DNAmarker和蛋白marker为Takara公司产品.柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.NucleoTrapGelExtraction试剂盒购于CLONTECH公司.Ni-NTAspinkit为QIAGEN公司产品.  1.2方法  1.2.1PCR反应及产物的鉴定  PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG,反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACT

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