rna干扰对流感病毒np和pa基因表达及病毒增殖的抑制

《rna干扰对流感病毒np和pa基因表达及病毒增殖的抑制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制作者：李瑶琛，赵志刚，李康生【关键词】正粘病毒科RNAinterferencemediatedinhibitionofinfluenzavirusNPandPAgeneexpressionsandmultiplicationinMDCKcells　　【Abstract】AIM:ToapplythesmallinterferingRNAstargetingNPor/andPAgeneofinfluenzavirustoinhibittheexpressionofNPor/andPAandmultiplicationofinf

2、luenzavirusinMadinDarbycaninekidney(MDCK)cells.METHODS:Therebinantplasmids,pEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NP+PAinedusingfluorescencemicroscopy.TheexpressionlevelsofNPgeneinedbyDCKcellstransfectedonstratedthattheinhibitoryabilityofpEGFP/NP+PAongthevariousgroups.CONCLUSION:ThesmallinterferingRN

3、AstargetingNPor/andPAgeneshoaticinhibitiononprotEInexpression,RNAtranscriptionandmultiplicationofinfluenzavirusinMDCKcells.　　【Keyyxoviridae;MDCKcellline;NPgene;PAgene　　【摘要】目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法：分别构建针对NP，PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP，

4、pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，转染MDCK后，H5N1亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值（HA），观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力.结果：荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达65.0%.蛋白质印迹结果表明，重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP+PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达，两者的抑制率分别为64.5%和69.6%.半定量RTPCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%；pG

5、enesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%；pEGFP/NP+PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率，分别为71.4%和69.3%.而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用.HA结果表明，三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖，以pEGFP6/NP+PA的作用最为显著，它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%，75.0%和96.9%.结论：NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达，并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.　　【关键词】RNA干扰；正粘病毒科；MDCK细胞株；NP

6、基因；PA基因　　0引言　　近来，禽流感在世界各地频繁爆发，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失［1］，也严重威胁到人类的健康［2］.高致病性的H5N1亚型是较为严重的一类［3］.而现有的、针对HA和NA的流感疫苗在流感病毒新亚型出现时却无能为力［4］.我们利用RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)［5］，选择在A型流感病毒复制过程中起重要作用的RNA聚合酶PA（polymeraseacidicprotein,PA）或/和核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列，将其分别或同时克隆入表达载体，在马丁达比狗肾（Mad

7、inDarbycaninekidney，MDCK）细胞中，观察诱导PA或NP基因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.　　1材料和方法　　1.1材料pEGFP和pGenesil1载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供.限制性核酸内切酶购自NEB公司.连接酶、DNAMarker由Takara公司提供.转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen.兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司，βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.