rna干扰对流感病毒np和pa基因表达及病毒增殖的抑制论文

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1、RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制论文李瑶琛，赵志刚，李康生【关键词】正粘病毒科RNAinterferencemediatedinhibitionofinfluenzavirusNPandPAgeneexpressionsandmultiplicationinMDCKcells【Abstract】AIM:ToapplythesmallinterferingRNAstargetingNPor/andPAgeneofinfluenzavirustoinhibittheexpressionofNPor/andPA

2、andmultiplicationofinfluenzavirusinMadinDarbycaninekidney(MDCK)cells.METHODS:Therebinantplasmids,pEGFP/NP,pGenesil/PAandpEGFP/NP+PAinedusingfluorescencemicroscopy.TheexpressionlevelsofNPgeneinedbyDCKcellstransfectedonstratedthattheinhibitoryabilityofpEGFP/NP+PAongth

3、evariousgroups.CONCLUSION:ThesmallinterferingRNAstargetingNPor/andPAgeneshoaticinhibitiononproteinexpression,RNAtranscriptionandmultiplicationofinfluenzavirusinMDCKcells.【Keyyxoviridae;MDCKcellline;NPgene;PAgene【摘要】目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基

4、因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.方法：分别构建针对NP，PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP，pGenesil/PA和pEGFP/NP+PA，转染MDCK后，H5N1亚型流感病毒感染细胞，荧光显微镜判断转染效率.freeleraseacidicprotein,PA）或/和核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因中的高度保守序列作为siRNA靶序列，将其分别或同时克隆入表达载体，在马丁达比狗肾（MadinDarbycaninekidney，MDCK）细胞中，观察诱导PA或NP基

5、因沉寂情况，以期具有更高的抑制效能，为预防与治疗流感寻找一种有效的措施.1材料和方法1.1材料pEGFP和pGenesil1载体由武汉晶赛生物技术有限公司提供.限制性核酸内切酶购自NEB公司.连接酶、DNAMarker由Takara公司提供.转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen.兔抗人NP抗体购于晶美生物工程有限公司，βactinmAb及HRP聚合的羊抗兔IgG购自Sigma公司.1.2方法选用流感病毒A/Pheasant/Shantou/44/2004(H5N1亚型，2004.1.5分离).

6、将病毒接种于10d鸡胚尿囊腔中，置于37℃的孵箱中，于病毒接种后的48h收获尿囊液，冻融、离心后分装贮存于-70℃备用.测定其空斑形成单位（plaqueformingunits,PFU）及感染复数（multiplicityofinfection，MOI）.据文献［6］，结合siRNA序列设计原则，确定PA2087和NP1496各19个单核苷酸作RNA干扰靶序列.正义链：5＇gatccggatcttatttcttcggagttcaagacgctccgaagaaataagatccttttttgaattca3＇，反义链：3＇gcct

7、agaataaagaagcctcaagttctgcgaggcttctttattctaggaaaaaacttaagttcga5＇;PA2087，正义链：5＇gatccgcaattgaggagtgcctgattcaagacgtcaggcactcctcaattgcttttttgagctca3＇，反义链：3＇gcgttaactcctcacggactaagttctgcagtccgtgaggagttaacgaaaaaactcgagttcga5＇，上述两序列的5＇端和3＇端分别引入BamHI和HindIII的酶切序列，也在HindIII位点

8、内侧分别引入EcoRI和SacI的酶切位点，以便将两个RNA干扰序列以串连的方式克隆入同一个载体中的两个U6启动子后，即U6promoterNPU6promoterPA，这样可同时产生两个RNA干扰序列.等量的正反义寡核苷酸（长65nt）混合、退火后分别插入经BamHI和Hi