rhoc-sirna表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响

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1、RhoC?siRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响郑文建梁平赵弘智韩克强【摘要】目的构建RhoC?siRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法以脂质体转染法稳定转染人SK?Hep1肝癌细胞株，ethodsRhoC?siRNAgeneigration,andcellinvasionbeforeandaftertransfectionedigestionandDNAsequencingconfirmedthattheRhoCspecificsiRNAexpressionvectorigration,andcellinvasionarke

2、dly,etastasis,ayprovideanovelapplicablestrategyforgenetherapyofHCC.【Keyors;Invasion;RhoC?siRNARho(rashomologous)基因亚家族成员(RhoA、B、C)是一类与ras同源的小GTP结合蛋白，Rho亚家族蛋白的异常表达可能与恶性肿瘤的侵袭、转移有关。有资料表明，RhoC基因产物的过量表达与肝癌发展及侵袭、转移有密切关系［1］。本研究通过构建RhoC特异性siRNA真核表达载体，并稳定转染到肝癌细胞株SK?Hep1中，以探讨抑制RhoC蛋白表达对肝癌细胞侵袭转移能

3、力的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株、菌株及质粒：人肝癌细胞株SK?Hep1购自中科院上海细胞所，大肠杆菌DH5α感受态细胞由新桥医院中心实验室保存，质粒pSilencer2.1为Ambion公司产品。1.1.2酶和试剂：新生牛血清购自PAA，RPMI1640购自Hyclone，G418购自BPI，DOTAP购自Roche，羊抗人RhoC多克隆抗体购自SantaCruz，HRP标记的兔抗羊二抗购自北京中杉公司，质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自中鼎公司，T4DNALigase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、λ?EcoT14ⅠMarker购

4、自TaKaRa。其他试剂均为分析纯。1.1.3模板DNA：插入双链寡核苷酸基因片段(BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ)，A：5′?GATCCGGATCAGTTTCCGGAGGTCTTCAAGACGGACCTCCGGAAACTGATCCTTTTT?TGTCGACA?3′，B：3′?GCCTAGTCAAAGGCCTCCA?GAAGTTCTGCCTGGAGGCCTTTGACTAGGAAAAAA?CAGC?TGTTCGA?5′，由武汉晶赛生物公司合成。其编码的siRNA为AAGGATCAGTTTCCGGAGGTC，该序列

5、经Blast查询与人类其他基因无同源性。通用阴性对照质粒pSilencer2.1?HK为武汉晶赛生物公司产品。其编码的siRNA为ACTACCGTTGTTATAGGTG，该序列经过Blast比较，与人、鼠基因库无明显同源。1.2方法1.2.1pSilencer2.1真核表达载体的构建及鉴定：按基因克隆方法构建重组质粒pSilencer2.1?RhoC?siRNA，经扩增并提取质粒后，用SalⅠ做酶切鉴定，并送上海英骏公司进行DNA全长自动测序。1.2.2重组体转染SK?Hep1细胞及转染后细胞中RhoC表达的检测：分别用pSilencer2.1?RhoC?siRN

6、A和pSilencer2.1?HK转染SK?Hep1细胞，48h后稀释传代并在培养基中加入G418(300μg/ml)筛选培养2周左右，将抗性细胞克隆转至培养瓶中培养并传代建系，分别命名为SK?Hep1/RhoC?siRNA和SK?Hep1/HK细胞。收集细胞，用RIPA液裂解，离心取上清液行atrigel(1mg/ml)的24孔板中常规培养：(1)1h后按MTT比色法测各孔细胞的OD570值，并计算黏附率(黏附率=黏附细胞OD570值/总细胞OD570值×100%)；(2)细胞基本长满后划痕，以无血清培养液培养48h后观察细胞向划痕区的迁移能力。(责任编辑：)1

7、.2.4细胞侵袭分析：Boyden小室法［2］。培养16h后计数PET膜下表面5个400倍显微视野中的细胞数，以侵袭细胞的相对数目反映细胞的侵袭能力。每组平行设3个小室。1.3统计学分析采用SPSS10.0软件进行统计分析，对不同的数据资料分别采用t检验及χ2检验。2结果2.1pSilencer2.1真核表达载体的构建与鉴定2.1.1重组载体的酶切鉴定：将pSilencer2.1、pSilencer2.1?HK及重组的pSilencer2.1?RhoC?siRNA质粒分别进行SalⅠ酶切电泳(图1)。质粒pSilence2.1的序列里没有SalⅠ的酶切位点，不能被

8、SalⅠ所