rhocsirna表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响

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1、RhoCsiRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞体外侵袭能力的影响作者：郑文建梁平赵弘智韩克强【摘要】目的构建RhoCsiRNA表达载体，研究其对肝癌细胞体外侵袭潜能的影响。方法以脂质体转染法稳定转染人SKHep1肝癌细胞株，Western印迹鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况，观察转染前后细胞黏附、运动及体外侵袭能力的改变。结果酶切及测序证实RhoCsiRNA真核表达载体构建成功。通过Western印迹检测证实，转染RhoCsiRNA表达载体的肝癌细胞中RhoC蛋白表达抑制达60%，其黏附、移动

2、及体外侵袭能力均降低。结论RhoCsiRNA表达载体能有效抑制RhoC在肝癌细胞株SKHep1中的表达，同时抑制细胞的侵袭转移潜能，为肝癌的生物学治疗提供新的方法。【关键词】肝肿瘤；侵袭；RhoCsiRNA【Abstract】ObjectiveToconstructaRhoCsiRNAexpressionvectorandstudyitsroleininvasionandmetastasisabilityofhepatomacarcinomacells(HCC).MethodsRhoCsiRNAgen

3、ewassynthesizedandclonedintotheexpressionvectorpSilencer2.1.TheconstructedRhoCsiRNAexpressionvector11wasstablytransfectedintoSKHep1ofHCC.ByusingWesternblotting,theinhibitiveeffectofRhoCsiRNAonexpressionofRhoCintransfectedHCCwasdetected,theabilityofcelladh

4、esion,cellmigration,andcellinvasionbeforeandaftertransfectionwereobservedtoo.ResultsEnzymedigestionandDNAsequencingconfirmedthattheRhoCspecificsiRNAexpressionvectorwasconstructedsuccessfully.Aftertransfection,theRhoCexpressionwasinhibitedby60%,andtheabilityo

5、fcelladhesion,cellmigration,andcellinvasionwasdecreasedmarkedly,whichwasprovedbyWesternblotting.ConclusionsRhoCsiRNAexpressionvectorcaneffectivelysuppressRhoCexpressioninSKHep1ofHCCanddecreasepotentialofcellinvasionandcellmetastasis,whichmayprovideanovelap

6、plicablestrategyforgenetherapyofHCC.【Keywords】Livertumors;Invasion;RhoCsiRNARho(rashomologous)基因亚家族成员(RhoA、B、C)是一类与ras同源的小GTP结合蛋白，Rho亚家族蛋白的异常表达可能与恶性肿瘤的侵袭、转移有关。有资料表明，RhoC基因产物的过量表达与肝癌发展及侵袭、转移有密切关系［1］。本研究通过构建RhoC特异性siRNA真核表达载体，并稳定转染到肝癌细胞株SK11Hep1中，以探讨抑制RhoC蛋白

7、表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株、菌株及质粒：人肝癌细胞株SKHep1购自中科院上海细胞所，大肠杆菌DH5α感受态细胞由新桥医院中心实验室保存，质粒pSilencer2.1为Ambion公司产品。1.1.2酶和试剂：新生牛血清购自PAA，RPMI1640购自Hyclone，G418购自BPI，DOTAP购自Roche，羊抗人RhoC多克隆抗体购自SantaCruz，HRP标记的兔抗羊二抗购自北京中杉公司，质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自中鼎公司，T4DNAL

8、igase、BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ、λEcoT14ⅠMarker购自TaKaRa。其他试剂均为分析纯。1.1.3模板DNA：插入双链寡核苷酸基因片段(BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+终止信号+SalⅠ+HindⅢ)，A：5′GATCCGGATCAGTTTCCGGAGGTCTTCAAGACGGACCTCCGGAAACTGATCCTTTTTTGTCGA