玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜müller细胞内erk1-2磷酸化水平增高论文

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1、玻璃体内注射谷氨酸导致大鼠视网膜Müller细胞内ERK1/2磷酸化水平增高论文周润海严宏段小莉王百忍【关键词】谷氨酸IntravitrealglutamateinjectioninducesanincreasedphosphorylationofERK1/2inretinalMüllercellsofrats【Abstract】AIM:ToanalyzethechangesofphosphoERK1/2inretinalMüllercellsbyusinganintravitrealglutama

2、teinsultandtoexploretheneuroprotectionroleofactivated(phosphorylated)ERK1/2againstglutamatecytotoxicityinretina.METHODS:A2μLofsalineorglutamate(375nmol)unilateralvitreousbodyfor3dor7din18SDrats.Theratslydividedinto3groups:Controlgroup(salineinjections)

3、,glutamateinjections3dgroupandglutamateinjections7dgroup.ThechangesoftheactivatedERK1/2munohistochemicalstainingandputerpictureanalyticsystem.RESULTS:After7dintravitrealglutamateinsult,theactivatedphenotypesofretinalcellsexhibitedahypertropicmorphology

4、andincreasedimmunostainingforERK1/2.Bythestainingpatterninshapeandlocalization,thepositivecellsedtobeMüllercells.Thegraylevelofglutamateinjections7dgroupongthe3groups.Thedifferencebetateinjections7dgroupandothertateinsultsuggeststhatphosphoERK1/2playsa

5、nimportantneuroprotectiveroleatecytotoxity.【Keyicacid;retinalMüllercells;ERK1/2【摘要】目的：观察大鼠玻璃体内注射谷氨酸后视网膜Müller细胞内ERK1/2分子的磷酸化水平，为探讨ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性损伤视网膜时的保护作用提供形态学证据.方法：SD大鼠18只，随机分为生理盐水对照组、谷氨酸注射后3d组和7d组，每组6只.随机选取大鼠的一只眼进行玻璃体内注射，实验组注射谷氨酸(375nmol)2μL，对照组注

6、射等量生理盐水，注射后3或7d后，取出眼球作冰冻切片.freelｇ/kg行ip麻醉,用5ｇ/Ｌ丁卡因点眼2次行眼表麻醉，用10μL的微量注射器（上海医用激光仪器厂）经颞侧巩膜刺入玻璃体内，处理组玻璃体内注射375nmol的谷氨酸（美国Sigma公司，粉剂用生理盐水溶解）2μL［3］，对照组眼内注射生理盐水2μL.13标本固定和切片每组模型建好后，动物成活3或7d，然后用10g/L戊巴比妥钠（80mg/kg）行ip麻醉，麻醉后开胸,经心脏用100mL生理盐水和40g/L多聚甲醛(pH74)固定液500

7、mL灌注,取出眼球,用200g/L蔗糖溶液后固定.将眼球用TissuTek包埋,在－20℃的冰冻切片机内做眼球矢状冰冻切片，片厚16μm.切片在－20℃保藏.14免疫组织化学染色采用免疫组化ABC染色法.10mmol/LPBS漂洗5min×3次；30g/LH2O2封闭30min；10g/L牛血清白蛋白和30mL/L正常羊血清在室温分别孵育切片20min；切片浸入3mL/LTriton×100大约5min；兔抗pERK1/2抗体（1∶1000,Sigma公司）室温下孵育切片24h；生物素化的羊抗兔Ig

8、G（1∶500,Vector公司）室温下孵育4h；生物素辣根过氧化物酶复合物（ABC,1∶500Vector公司）室温孵育2h；硫酸镍铵加强DAB蓝色反应呈色，当阳性产物呈深蓝色而背底几乎无色时终止反应,.freelement570图像分析仪，放大倍数为40×，用Quic图像分析软件测得视网膜免疫反应强度（平均灰度，染色越深灰度值越小，最黑为0），每个切片随机选择3个视野，测定阳性细胞的灰度值，以平均值作为判断该大鼠视网膜上的pERK表达水平的标准.统计学处理3组均数