shrna靶向干扰bhrf1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究

《shrna靶向干扰bhrf1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、ShRNA靶向干扰BHRF1基因抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究张艳平常德职业技术学院医学系，湖南常德415100[摘要]目的观察BHRF1shRNA质粒载体转染对人鼻咽癌E2细胞中的BHRF1基因沉默及细胞增殖和凋亡的影响，以及肿瘤细胞对放射敏感性的变化。方法利用RNAi技术将负载BHRF1shRNA的质粒载体转染至人鼻咽癌E2细胞，一组为BHRF1shRNA质粒载体转染过的E2细胞（观察组），未进行转染的E2细胞确定为对照组，经RT-PCR扩增人鼻咽癌组织中BHRF1cDNA片段，RT-PCR和I-1640完全培养基购自美国Gibco公司。Lipofectamine2000购自美国Invi

2、trogen公司。蛋白提取试剂：碧云天RIPA蛋白提取及配套试剂。蛋白定量试剂：碧云天BCA蛋白定量试剂盒。实验仪器：转膜仪BIO-RAD半干式转膜仪。1.2方法进行转染，然后RT-PCR和RTReagentKit）操作说明执行。取上述RT反应液加入下一步RealTime-PCR反应体系，按下列组份配制RealTime-PCR反应体系，共20μL：10μLPremixExTaqTMⅡ(2×)，0.8μL上游引物，0.8μL下游引物，2μLcDNA，0.4μLROXReferenceDye(50×)，ddH2O定容到20μL。反应条件：预变性95℃15m；变性94℃60s，退火58℃60s，

3、延伸72℃60s，共40个循环。得出各标本基因和β-actin基因表达量的相关数据（Ct值），数据经内参照基因校正后，按下列公式计算PANC-1mRNA相对表达量。公式：细胞系PANC-1mRNA相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct(PANC-1)-Ct(β-actin)。数据采用仪器自带软件分析:ABIPrism7500SDSSoftan等级相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1BHRF1mRNA表达变化RT-PCR检测结果显示，观察组的BHRF1mRNA表达比较转染前发生显著降低(P<0.01)。与对照组细胞BHRF1mRNA表达相比也明显降低(P<0.

4、05)。详细数据见表1所示。2.2对DDP的敏感性为了进一步探讨BHRF1shRNA质粒载体转染后的癌细胞后对DDP的敏感性的变化，我们检测了两组细胞对DDP的敏感性。经过实验，得出两组癌细胞在DDP使用以后24h和48h的抑制率。具体数据见下表2所示。结果（mean±SD）说明DDP作用24h和48h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA明显更加有效(P<0.05)，说明导入BHRF1shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。3分析关于BHRF1shRNA通过何种途径发挥其抑制了鼻咽癌细胞增殖作用，本文通过实验结果已经证实。在本研究中RT-PCR检测结果

5、显示，观察组的BHRF1mRNA表达比较转染前发生显著降低(P<0.01)。与对照组细胞BHRF1mRNA表达相比也明显降低(P<0.05)。说明了BHRF1shRNA可靶向抑制BHRF1mRNA的表达，使E6蛋白表达下调，减小对p53的降解作用，从而恢复p53蛋白的功能活性，p53蛋白积累，DNA复制停止，介导细胞停滞在G1期，分析可能是其抑制鼻咽癌细胞生长的重要机理之一，该研究为进一步研究通过干扰基因表达对癌细胞增殖的抑制方面提供了理论基础。目前，临床报道的文献多采用免疫组化的方法检测到鼻咽癌组织中p53蛋白呈阳性表达，但很少发现p53基因有突变。因鼻咽癌不同于其他部位的肿

6、瘤，癌组织内p53基因突变率极低。这就意味着野生型p53蛋白功能失活在鼻咽癌的恶性转化和肿瘤的发生发展中起着十分重要的作用。Huang等在研究p53表达与鼻咽癌及癌前病变之间的关系时指出，p53蛋白的过度表达不仅与肿瘤的发生有关，而且与鼻咽癌的分期显著相关。而且本研究还检测了两组细胞对DDP的敏感性，经过实验得出两组癌细胞在DDP使用以后24h和48h的抑制率。结果（mean±SD）说明DDP作用24h和48h以后对shRNA细胞的抑制率较NshRNA明显更加有效(P<0.05)，说明导入BHRF1shRNA质粒载体的细胞增加了鼻咽癌细胞对化疗药物DDP的敏感性。综上所述，本研究利用

7、RNA干扰技术对人鼻咽癌治疗具有潜在应用价值，BHRF1shRNA质粒载体不仅仅能调控细胞基因的表达，而且还能够提高癌细胞对顺铂的敏感性。[.jyqkanJG,等.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998,120-145.[2]PrattZL,KuzembayevaM,SenguptaS,etal.ThemicroRNAsofEpstein-BarrVirusareexpressedat