阿司匹林抑制肺癌细胞增殖的实验研究

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1、阿司匹林抑制肺癌细胞增殖的实验研究作者：刘国华，陈燕明，冯一中【摘要】目的观察阿司匹林在体外对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法采用噻唑蓝(MTT)法观察阿司匹林及与奥沙利铂联用抑制A549细胞的增殖；采用流式细胞仪(FCM)观察阿司匹林处理后A549细胞周期分布的变化；采用HE染色和DNA末端原位标记染色技术(TUNEL)观察阿司匹林处理后诱导A549细胞凋亡的作用。结果MTT显示阿司匹林呈剂量依赖方式抑制A549细胞增殖。阿司匹林作用后，FCM显示G0/G1期细胞比例增加，S期和G2/M期细胞比例降低，TUNEL显示细胞凋亡指数(AI)由3.67%±1.15%

2、增加到26.33%±2.52%，呈一定剂量效应关系。光镜下可见典型的细胞凋亡形态学变化。阿司匹林(2.5mmol/L)与奥沙利铂(≥6.25ug/mL)联用可增强抑制A549增殖的作用，二者呈协同或相加作用。结论阿司匹林可抑制肺腺癌细胞A549的增殖，其影响细胞周期分布、诱导细胞凋亡可能是其重要的机制。阿司匹林及与奥沙利铂联用有显著的协同抗增殖效应。【关键词】阿司匹林；肺癌；细胞增殖；奥沙利铂ExperimentalStudyonInhibitiveEffecsofAspirinontheProliferationofHumanLungCancerCellsKeya公

3、司，实验前先溶于无水乙醇，配制成1000X浓度，再用培养基稀释1000倍，所有实验组及对照组培养液内乙醇终浓度均<0.5%，预实验对细胞增殖没有影响。奥沙利铂由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。RPMI1640培养液购自Gibco公司，含10%灭活小牛血清，100u/mL青霉素及100u/mL链霉素。噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。RNA酶(Rnase)及碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。原位酶标记法(TUNEL)试剂盒购自Roche公司。1.1.3主要仪器美国SHELLAB2300型恒温CO2细胞培养箱，日本OLYMPUSBH2型

4、光学显微镜，美国Biotect2550型自动酶标光度仪，美国COULTEREPICSXL型流式细胞仪等。1.2方法1.2.1细胞培养将肺腺癌细胞株A549置于RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。1.2.2MTT比色法取对数生长期的A549细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，培养24h后换液，设实验组(加不同浓度的干预药物)、空白调零组(不接种细胞)及对照组(只含等量溶剂)，每组设四个复孔。48h后每孔加入MTT20μL，继续培养4h后1000r/min离心5min，吸出上清液，每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡10min，于酶标仪5

5、70nm波长处测定各孔吸光度值(A值)。计算细胞增殖的抑制率：抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。计算Q值并判断两药的联合效应[2]：Q=E(A+B)/[EA+(1－EA)×EB]，其中E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率。Q为0.85～1.15表示两药作用相加，Q>1.15表示两药作用协同，Q<0.85表示两药作用拮抗。1.2.3流式细胞仪检测细胞周期分布取对数生长期的A549细胞按1×106/瓶个细胞接种于100mL培养瓶中，培养24h后换液。实验组阿司匹林终浓度分别为5.0mmol/L、10.0mmol/

6、L，设不加药对照组,每组每个浓度重复3瓶。48h后收集细胞，吹打成细胞悬液，PBS洗涤，1000r/min离心5min后弃上清液，加入70%冷乙醇固定，4℃放置1h，取出后用PBS漂洗，1000r/min离心5min后弃上清液，加入0.01%Rnase1mL，37℃水浴温箱振荡10min，1000r/min离心5min后弃上清液，加入0.05%碘化丙啶(PI)1mL染色，用400目筛网过滤后置于4℃冰箱，20min后上机检测。计算细胞增殖指数（PI）：PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。1.2.4HE、TUNEL染色法检测细胞凋亡(1)细胞形态

7、学观察取对数生长期的A549细胞以每孔2×104个细胞接种在置有玻片的24孔培养板内，培养24h后换液。实验组阿司匹林终浓度分别为5.0mmol/L、10.0mmol/L，设不加药对照组，每组每个浓度设3个复孔。48h后取出玻片，冷丙酮固定30min，PBS漂洗，室温风吹干。作HE染色，光镜下观察。(2)DNA末端原位标记染色法(TUNEL)按(1)制备肿瘤细胞玻片。48h后4%多聚甲醛固定30min，蛋白酶K消化，0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，加入TdT和BiodUTP混合液37℃孵育60min，SABC室温30min，DAB显色，苏