survivin反义核酸影响a549肺癌细胞增殖和凋亡的研究论文

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1、Survivin反义核酸影响A549肺癌细胞增殖和凋亡的研究论文郑人源蒲铃玲刘桦潘克俭王玉明【摘要】目的研究Survivin反义寡核苷酸对A549细胞增殖和凋亡的影响。方法针对SurvivinmRNA序列设计了反义寡核甘酸，转染A549细胞，PT-PCR检测细胞中survivin基因的mRNA含量；TT法检测细胞增殖，TUNEL法检测细胞凋亡。结果Survivin反义寡核苷酸可明显降低A549细胞中survivin的mRNA和蛋白水平。MTT比色法结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制A549细胞增殖，抑制率远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。TUNEL法

2、检测结果显示，反义寡核苷酸还显著增强A549细胞对抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。结论survivin反义寡核苷酸有望应用于肿瘤的辅助治疗之中。【关键词】Survivin；反义寡核苷酸；A549细胞；增殖；凋亡Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotidetotheproliferationandapoptosisofA549cells.MethodsDesignedahumansurv

3、ivinantisenseoligonucleotidesandtransfecteditintoA549cells.TheexpressionofsurvivinmRNAandthelevelofproteinethodsrespectively.TheMTTassayeasuredbyTUNELassay.ResultsThequantityofsurvivinmRNAandthelevelofproteinuchhigherthantherateofthecontrol.Theapoptoticrateobtainedbytransfectingcel

4、lsoharringtonine.ConclusionTheexperimentresultsindicatethatantisenseoligonucleotidecandeserveasanapproachtosubservienttumortherapyinfuture.KeyRNA序列设计了反义寡核苷酸，抑制Survivin蛋白的合成，验证了Survivin反义寡核苷酸能抑制A549细胞增殖，提高细胞对抗肿瘤药物高三尖杉酯碱（homoharringtonine,HHT）的敏感性。1材料与方法1.1试剂和细胞株A549肺癌细胞株由四川大学生命科学院细胞

5、生物学教研室赠送。脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自SantaCruz公司；兔抗Survivin多克隆抗体购自SantaCruz公司；逆转录试剂盒购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于博士德公司；细胞凋亡DNA片段原位末端标记(TUNEL)试剂盒购自BoehringerMannheim公司。高三尖杉酯碱购于四川大学华西医院药房。1.2反义寡核苷酸应用RNAstructure315对人survivinmRNA的二级结构进

6、行了模拟,依此设计并合成了反义寡核苷酸ASODN链和无义链，两端各有5个碱基硫代修饰,由上海生工公司合成。反义寡核苷酸序列：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’无义寡核苷酸序列：5’-GCCACTCCTCGACTCTCGTG-3’1.3细胞转染A649细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养液，37℃,5%CO2中培养,胰酶消化,计数,分别接种于96孔细胞培养板(每孔细胞6000个)和6孔板，37℃培养过夜,在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行反义寡核苷酸和无义寡核苷酸的转染,空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPM

7、I1640培养液。6h后移去含脂质体的培养液，换为含10%血清的RPMI1640培养液继续培养。1.4RT-PCR检测TRIZOL法提取6孔板内细胞的总RNA，用紫外分光光度仪定量；各样本取1μg总RNA进行逆转录，取cDNA5μl/样本，加SurvivinPCR引物，同时加入β-actin引物作为内对照，双引物常规PCR反应，25个循环。琼脂糖电泳检测PCR产物。1.5TT法检测细胞增殖细胞转染后,继续在96孔细胞培养板培养24、48、72h；在以上时段分别加入MTT，测其A490值,.freelol/L。每组均设8个平行孔(取平均值作为1次实验结果),并

8、重复3次(批)实验。反义寡核苷酸对细胞生长的抑制率=