利用sirna抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达

《利用sirna抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达作者：李鲲，杨述华，刘红云，傅德皓，宁旭，梅荣成【摘要】目的构建生存素（survivin）短发夹状RNA表达载体，检测其对骨肉瘤细胞survivinmRNA及蛋白表达的影响。方法体外构建survivinshRNA表达载体pSilence2.1neosurvivin,转染骨肉瘤细胞系MG63，RTPCR、免疫组化方法检测转染前后survivinmRNA及蛋白的表达，MTT比色法检测细胞增殖活性。结果pSilence2.1neosurvivin载体转染能显著抑制survivinmRNA、蛋白表达，转染

2、后48h细胞增殖的抑制率为61.83%。结论pSilence2.1neosurvivin可显著抑制MG63细胞survivinmRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。【关键词】survivin；RNA干扰；短发夹RNA；骨肉瘤InhibitionoftheExpressionofsurvivininOsteosaraCellbyAShortHairpinRNAKeyine2000为Invitrogen公司产品，pSilence2.1neo为Ambin公司产品，RTPCR试剂盒为MBI公司产品，鼠抗人survivin单克隆抗体及SP试剂盒为SantaCr

3、uz公司产品。1.2实验方法1.2.1pSilence2.1neosurvivin表达载体构建及细胞转染参照Harborth等［1］的干涉RNA设计原则，以人survivin的mRNA序列5′TTCGTCCGGTTGCGCTTTC3′为靶点，体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点、内含5TTCGTCCGGTTGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCAACCGGACGAA3发夹状序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence2.1neo载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分4组进行细胞转染处理：空白组、脂质体组、空载

4、体组、shRNA组。1.2.2RTPCR检测细胞survivinmRNA的表达分别收集转染24、48、72h细胞,提取细胞总RNA，并进行逆转反应。引物的序列为：survivin：上游：5′ATGGGTGCCCCGACGTTG3′下游：5′AGAGGCCTCAATCCATGG3′，扩增产物436bp。βactin：上游：5′TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3′下游：5′CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3′，扩增产物172bp。以survivin与βactin条带的积分吸光度（IA）比值表示survivinm

5、RNA的相对含量。1.2.3免疫组化法检测survivin蛋白的表达按上法处理细胞24、48、72h后，SP法进行免疫组化染色。以细胞浆和/或核呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，并计算阳性表达率：阳性表达率=（每500个细胞中阳性细胞数/500）×100%。1.2.4MTT法检测细胞增殖活性按上法处理细胞24、48、72、96h后，行MTT染色，测OD值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组OD值处理组OD值）/空白组OD值×100%。1.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件，对数据进行t检验。2结果2.1RTPCR结果shRNA组436bp处的

6、条带亮度显著低于其余各组，见图1，与空白组相比shRNA组24、48、72hmRNA表达抑制率分别为68.52%、74.87%和71.93%，其抑制作用在24～48h逐步增加，48～72h有所减低，余各组之间无明显差别，见表1。表1survivinshRNA对MG63细胞survivinmRNA表达的影响2.2免疫组化结果空白组、脂质体组、空载体组多数细胞中均出现明显的棕黄色的颗粒状细胞浆和/或核着色，见图2，而shRNA组细胞着色较淡，阳性细胞数目较少，见图3。统计结果显示，shRNA组survivin蛋白表达明显低于其他组，见表2。表2survivins

7、hRNA对MG63细胞survivin蛋白表达的影响2.3MTT比色法比较细胞增殖活性与空白组相比，载体转染后24、48、72、96h细胞的增殖活性均受到了显著抑制，48h抑制率最高，为61.83%。其他组间细胞的增殖情况的差异无统计学意义，见表3。3讨论RNAi是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA（double－strandedRNA,dsRNA）引起同源mRNA特异性的降解，从而高度特异性、高效性地抑制目的基因表达的技术。利用siRNA干涉技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，可表3MTT法检测s

8、hRNA对MG63人骨肉瘤细胞增殖的