利用sirna抑制her2表达的研究

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1、利用siRNA抑制HER2表达的研究【关键词】siRNA　　TheInhibitionofHER2ExpressionbysiRNA　　Abstract：ObjectiveToinhibittheexpressionofHER2geneinMCF7humanbreastcarcinomacellsbysiRNA.MethodsFivesiRNAstargetingHER2edintoMCF7cells.Afterselection,thestabletransfectedcellsRNAabundanceinthestabletransfec

2、tedcellsetry(FCM).Thestabletransfectedcellsice,andtheHER2proteinexpressionintransplanttumormunohistochemicalmethod.ResultssiRNA3PcouldeffectivelydecreasetheHER2mRNAexpressioninMCF7cells.TheFCMdatashoorigenesisofMCF7cellsinnudemice.Correspondingly,theHER2proteinexpressionintr

3、ansplanttumorsRNAcouldeffectivelyinhibitHER2expressioninvivoandinvitro,andallinterferingRNA(siRNA);Breastcancer　　摘要：目的利用siRNA抑制人乳腺癌MCF7细胞中HER2基因的表达。方法针对HER2mRNA设计了5条siRNA，并构建相应的表达质粒，将质粒转染MCF7乳腺癌细胞，筛选稳定表达株，利用RTPCR分析siRNA对细胞中HER2mRNA的降解作用；利用流式细胞术分析细胞表面HER2蛋白的表达；利用裸鼠进行体内成瘤性实

4、验，用免疫组化法检测瘤组织中HER2的表达。结果siRNA3P能明显降低MCF7细胞中HER2mRNA的丰度；流式细胞分析表明，其中siRNA2P和3P稳定转染的MCF7细胞表面HER2的表达明显降低；五种表达不同siRNA的MCF7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低，并且瘤组织中HER2蛋白的表达也明显减少。结论靶向HER2mRNA的siRNA能在体内外有效抑制HER2的表达，可用于乳腺癌的基因治疗。　　关键词：HER2；小干涉RNA（siRNA）；乳腺癌　　0引言　　HER2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中存

5、在基因扩增或过度表达，而在正常人体腔上皮、腺上皮及胚胎中表达水平很低[1]。约30%的乳腺癌患者伴随HER2的过表达[2]，HER2过表达与乳腺癌的发生、发展、转移和不良预后密切相关。　　RNA干涉（RNAinterference,RNAi）是近年发展起来的一种快速、高效、易于操作的使特异靶基因失活的技术。本实验利用RNAi技术，以HER2基因为靶点，设计了5条小干涉RNA（smallinterferingRNA,siRNA），并从细胞及实验动物水平，观察了siRNA对HER2表达的特异性抑制作用，探讨siRNA作为肿瘤基因治疗的可行性和特异性。

6、　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞株人乳腺腺癌MCF7细胞株由本室保存，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、37℃、5%CO2孵箱中培养。　　1.1.2质粒pSilencerTM2.1U6hygrosiRNA表达载体购自Ambion公司。　　1.1.3试剂胎牛血清、RPMI1640培养基为GIBCOBRL产品；限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ，T4连接酶，TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，逆转录酶MMLV购自Promega公司；Trizol试剂，转染试剂Lipofectamine2000为Invitro

7、gen公司产品；HygromycinB购自Roche公司；HER2小鼠抗人单克隆抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中山公司。　　1.1.4实验动物4～6周龄雌性BALB/c裸鼠购自中国医学科学院动物研究所。　　1.2方法　　1.2.1发夹siRNA转录模板的设计发夹siRNA转录模板的结构如图1所示。siRNA的靶序列长度为19nt，两个反向互补排列的19nt特异性序列由一个9nt的Loop相连接，形成茎环结构。转录模板两端分别为BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。人HER2的mRNA基

8、因序列从GenBank获得，序列号为NM_004448，利用程序siRNADNA