云南红豆杉茎灰斑病病原菌分离鉴定和生物学特性研究

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1、云南红豆杉茎灰斑病病原菌分离鉴定和生物学特性研究谢美华１，李霖２，李雪玲１，杨海艳１，陈华红１，王振吉１，范树国１（１．楚雄师范学院化学与生命科学系，云南楚雄６７５０００；２．楚雄医药高等专科学校信息中心/云南省高校应用生物学重点实验室，云南楚雄６７５０００）摘要：对红豆杉（ＴａｘｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＣｈｅｎｇｅｔＬｕ）茎灰斑病进行病原鉴定，并研究其生物学特性和杀菌剂对其抑制作用。结果表明，该病原菌为拟茎点霉属真菌；该病原菌最适宜生长的碳源为甘油，氮源为硝酸铵。菌丝适宜生长的温度范围较窄，２５～２８℃菌丝生长良好，分生

2、孢子在３２℃时萌发率最高；菌丝适宜生长的ｐＨ范围均较广，分生孢子萌发率较高，菌丝适宜生长的ｐＨ为６．０～７．０，弱酸性更利于孢子萌发；光周期对菌落生长和分子孢子萌发的影响都不大。供试的杀菌剂中以代森锰锌的抑菌效果最好。..关键词：云南红豆杉（ＴａｘｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＣｈｅｎｇｅｔＬｕ）；茎灰斑病；病原鉴定；生物学特性中图分类号：Ｓ７１８．８１文献标识码：A：0439－８114（２０15）03－0608-04云南红豆杉（ＴａｘｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＣｈｅｎｇｅｔＬｕ）又名紫杉、赤柏松，属红豆杉科乔木，产于云南西北部

3、及西部、四川西南部与西藏东部［１］。主要生长在山坡、针阔混交林中。云南红豆杉的茎皮中富含具有抗癌活性成分的紫杉醇，由此使得红豆杉身价急剧上升。自然环境中的红豆杉资源非常稀缺，所以目前红豆杉已被大面积的人工栽培。围绕云南红豆杉的研究主要集中在浸种育苗、扦插栽培、内生真菌研究等方面，而对于云南红豆杉大面积栽培引起病害大量滋生及病害如何防治的方面［２－7］鲜见报道。本研究选取红豆杉茎皮灰斑病的病斑，进行该病害病原的分离鉴定和生物学特性研究，以期为云南红豆杉病害控制和防治提供一定的理论基础。１材料与方法１．１病原菌分离云南红豆杉茎灰

4、斑病茎皮采自楚雄师范学院内，用组织分离法进行病原菌株分离，经柯赫氏法则鉴定其为云南红豆杉茎灰斑病的病原，菌株编号为ｈｏｎｇｄｏｕｓｈａｎ０１。１．２病原菌鉴定１．２．１形态学鉴定经纯化分离得到病原菌，利用显微镜进行观察，对其进行形态鉴定。１．２．２病原茵ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列扩增和分析用ＣＴＡＢ法提取病原菌全基因组ＤＮＡ，进行ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增。引物序列为ＩＴＳ４：５－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３；ＩＴＳ５：５－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３。ＰＣＲ反应体系总体积２５μＬ，反应各成分终浓度为：

5、Ｔａｑ酶０．０２Ｕ/μＬ；引物０．４μｍｏｌ／Ｌ；ＤＮＡ模板２０ｎｇ/μＬ；ｄＮＴＰｓ０．４μｍｏｌ／Ｌ；２×ＰＣＲ反应缓冲液。ＰＣＲ扩增程序为：预变性９５℃，３ｍｉｎ；变性９４℃，３０ｓ，退火５２℃，４５ｓ，复性７２℃，４５ｓ，３０个循环；延伸７２℃，１０ｍｉｎ。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序，所得序列在ＮＣＢＩ上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用ＢｉｏＥｄｉｔ、Ｃｌｕｓｔａｌｘ和ＭＥＧＡ４．１软件采用ＮＪ法进行系统分析，构建系统进化树。１．３生物学特性研究［8,9］１．３．１不同碳源和氮源对菌落

6、生长的影响以察氏培养基为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、Ｄ－果糖、Ｄ－半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、Ｌ－苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中分别接种直径为５ｍｍ的菌块，２５℃恒温暗室培养，５ｄ后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设３个重复。１．３．２不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响取直径为５ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，分别在５、１０、１５、２０、２５、２８、３０、３２、３５、４０、４５℃暗室下恒温培养，５ｄ后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落

7、培养，２４ｈ后镜检孢子萌发率，每次检１００个孢子。每个处理设３个重复。１．３．３不同ｐＨ对菌落和孢子萌发的影响将高压灭菌后的察氏培养基ｐＨ分别调为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１０．９，倒平板，取直径５ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，黑暗条件下２５℃培养５ｄ后测量菌落直径。用０．２ｍｏｌ/Ｌ磷酸氢二钠和０．２ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液将分生孢子悬浮液ｐＨ调配为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１０．９，置于２５℃恒温箱暗室培养，２４ｈ后镜检萌发率，每次检１００个

8、孢子。每个处理设３个重复。１．３．４不同光照处理取直径为５ｍｍ的菌块接种于察氏培养基中央，分别置于２４ｈ光照、１２h/１２h光暗交替，２５℃培养５ｄ后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，２４ｈ后镜检孢子萌发率，每次镜检１００个孢子。每个处理设３个重复。１．４