不同条件下nk细胞在小鼠黑色素瘤内的浸润论文

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1、不同条件下NK细胞在小鼠黑色素瘤内的浸润论文嵇晶晶，包颖兰，于常华，崔凤，吕慧芳，徐玉清【摘要】目的比较DC及IL2，IL15维持NK细胞体内活性的作用效果。方法DAPI标记的NK细胞输入负瘤小鼠体内，同时分别给予DC、IL2及IL15.freelIL15，rmIL4，rmGMCSF购自英国PeprotechEC公司；DynabeadsM450CD8购自美国DynalBiotech公司；4，6联脒2苯基吲哚DAPI，购自美国Sigma公司。1.2动物模型的建立C57BL/6小鼠，雄性，18～22g，

2、8～12周龄（购自哈医大二院动物实验中心）。培养小鼠黑色素瘤细胞株B16（购自上海坤肯细胞库），小鼠背部皮下注射。1.3NK细胞的体外培养及标记将C57BL/6小鼠处死，取出脾脏制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加rhIL2至6000IU/ml，于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。第3天加入Dynabeads于4℃共同作用20min，去除CD8＋细胞2。加入新鲜RPMI1640培养基，隔日给rhIL2。第6、7天加入DAPI50mg/ml于恒温培养箱中培养3h后收集贴壁细胞备用。1.4

3、DC的体外培养将C57BL/6小鼠处死，取四肢骨骨髓制成单细胞悬液，裂解红细胞，洗涤后置于RPMI1640培养基中，加入10ng/mlrmGMCSF，10ng/mlrmIL4，于恒温培养箱中培养3。隔天半量换液，培养6～8天收集细胞备用。1.5MTT法测NK细胞杀伤活性靶细胞为B16细胞。分四组：①NK细胞对照组；②NK＋IL2（1000IU/ml）组；③NK＋IL15（10μg/ml）组；④NK＋DC组，NK与DC比分别为10∶1，1∶1，1∶10。效靶比5∶1，10∶1，20∶1，设立效应细胞对照孔（E），靶

4、细胞对照孔（T），反应孔（E+T），每组设三个复孔，测定的OD值取三孔均值，按以下公式计算：NK细胞杀伤活性（％）＝（1―ODE+T-ODEODT）×100％1.6黑色素瘤皮下模型内NK表达的测定将5×106个DAPI标记的NK细胞通过鼠尾静脉注入负瘤小鼠体内，分别给予不同剂量的IL2,IL15及DC，于6h，12h，24h将鼠处死，取瘤组织，做冰冻切片，荧光显微镜下观察；部分经3%戊二醛固定电镜观察。1.7统计学分析应用SPSS统计软件处理数据，采用t检验。2结果2.1NK细胞杀伤活性的比较效靶比为20∶1时实验组

5、NK细胞的杀伤活性均强于对照组。NK∶DC为1∶1时，杀伤活性较10∶1时有显著增强（Ｐ0.05），而再加大DC的剂量杀伤率未见增强。NK∶DC为1∶1时NK杀伤活性较IL2组及IL15组有所提高，但无统计学意义（Ｐ0.05），见表1。表1NK细胞杀伤活性的比较2.2电镜观察结果镜下肿瘤细胞周围可见NK细胞和DC细胞，见图1。DC表面有较多树突状突起，胞质内有溶酶体颗粒，细胞器较少，胞核形状不规则。NK表面有少量指状突起，胞质较多，细胞核呈卵圆形，核内染色质丰富，异染色质多分布在边缘。肿瘤细胞体积较大，约30～40μ

6、m，细胞表面可见密集分布的微绒毛，胞质内有较多的线粒体。图1可见DC的伪足正伸入瘤细胞体内，DC突起与瘤细胞质膜融合。靶细胞线粒体肿胀，胞质中出现空泡变性，核染色质破碎，最终溶解坏死。荧光显微镜下，肿瘤组织内可见淡蓝色荧光的DAPI标记的NK细胞，见图2。2.3NK细胞在肿瘤组织内的浸润与时间的相关性，见图3。NK细胞在肿瘤组织内的浸润呈时间依赖性。图3NK细胞在肿瘤组织的浸润与时间的关系2.4NK细胞在肿瘤组织内的浸润与剂量的关系，见图4。图4NK细胞在肿瘤组织内的浸润呈剂量相关性3讨论NK细胞是大颗粒淋巴细胞，可与肿

7、瘤细胞直接接触，通过穿孔素依赖机制介导靶细胞溶解坏死。在实验中观察到NK细胞可浸润到肿瘤组织内。有研究发现在肺、肝等脏器的转移瘤中也可见NK聚集，且要多于正常组织。YangQin2在实验中发现NK细胞在肿瘤组织内的浸润受到肿瘤组织形态的影响，疏松的肿瘤组织更适合于NK细胞的浸润。NK细胞静脉注入5天后，观察到肺转移瘤有所缩小。腹腔内注射NK细胞及PEGIL2可观察到腹腔内转移瘤较前缩小，而肺转移瘤则无明显变化。看来，NK细胞主要依赖于相互接触来识别并消灭靶细胞。以往的研究认为，NK细胞的存活与活化需要依赖于细胞因子。

8、长期培养的骨髓基质细胞上清中含有IL15，而未检测到IL2，故IL2可能仅参与外周血NK细胞的发育，而IL15极有可能是造血干细胞分化为NK细胞的天然调节因子4。那细胞因子的存在是NK细胞存活的必需条件么？我们的实验结果表明，无外源性细胞因子时DC可促进NK杀伤活性，观察24小时内，诱导NK细胞转移到肿瘤组织