不同佐剂增强小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤细胞免疫效应的比较

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1、不同佐剂增强小鼠黑色素瘤瘤苗抗瘤细胞免疫效应的比较：周伊，齐旭，马军，来宝长，司履生，王一理【摘要】目的评价5种不同配方佐剂在低免疫原性小鼠黑色素瘤瘤苗保护性免疫中的细胞免疫增强作用。方法实验组用5种不同配方的佐剂（FCA,FCA+IL2+GMCSF,FIA+IL2+GMCSF,FIA+SCSF）和照射灭活的D5黑色素瘤细胞制成瘤苗免疫小鼠，对照组免疫用单纯灭活D5黑色素瘤细胞。末次免疫后3天各组取半数动物检测DTH反应、NK细胞活性及特异性CTL活性，剩余半数动物接种活D5黑色素瘤细胞，3周后

2、再次检测上述各免疫学参数。结果与对照组相比，经免疫后的各实验组DTH反应、NK细胞活性、CTL活性均明显升高（P<0.05），但成瘤后随肿瘤增大，则呈下降趋势。结论5种佐剂配方制成的瘤苗均能诱导免疫小鼠对低免疫原性肿瘤的细胞免疫应答。其中佐剂SCSF、SGC803，由本室保存；小鼠白血病细胞YAC1，由第四军医大学免疫学教研室馈赠。　　1.1.2主要试剂　　rhIL2由四川肿瘤研究所提供；rmGMCSF由美国胡宏明博士馈赠；弗氏不完全佐剂（FIA）、弗氏完全佐剂（FCA）由本室保存；佐剂S

3、TT为Promega公司产品。　　1.2方法　　1.2.1瘤苗制备　　收获生长良好的D5细胞，经10000rad的60Co照射灭活，调整细胞浓度至2×107/ml备用。按下列配方制备5种佐剂瘤苗，即瘤苗A：FCA+灭活D5细胞，瘤苗B：FCA+rhIL2+rmGMCSF+灭活D5细胞，瘤苗C：FIA+rhIL2+rmGMCSF+灭活D5细胞，瘤苗D：FIA+SCSF+灭活D5细胞，并制备不加佐剂的灭活D5细胞瘤苗作为对照。瘤苗中的IL2按14×104U/kg、GMCSF按14μg/kg加入，

4、各组佐剂与灭活的D5细胞的体积比为1∶1，混合后分别制成油包水的乳剂疫苗及不含FIA或FCA的水剂疫苗(其余成分同上)，于4℃保存备用。　　1.2.2主动特异性免疫保护实验　　将小鼠随机分为6组，即注射瘤苗A、B、C、D、E的实验组和对照组，每组16只。各组小鼠接种不同瘤苗的量均为100μl（含1×106细胞数）。初次免疫后2、3、4周各强化免疫1次。其中前2次免疫用油包水的乳剂疫苗，后2次免疫用水剂疫苗。对照组免疫用单纯灭活D5细胞。末次免疫后3天，各实验组和对照组小鼠均处死一半，进行有关免疫学参数的测

5、定，剩余小鼠皮下接种D5细胞3×105个（50μl），3周后处死存活的小鼠，再进行有关免疫学参数的检测。　　1.2.3DTH反应　　采用足垫肿胀试验检测特异性迟发型超敏反应（DTH）。每批小鼠在处死前1天，于每只小鼠的左后足垫注射1×105个（50μl）D5细胞冻融液，24h后用游标卡尺测量左、右足垫的厚度（101mm），以左足垫的厚度减去右足垫的厚度计算肿胀反应。　　1.2.4NK细胞活性检测　　用MTT法检测NK细胞活性，效应细胞为小鼠脾细胞，浓度1×106/ml。靶细胞为YAC1细胞，浓度1×1

6、05/ml。效靶比例为10∶1，每个样本3个平行样。在酶联检测仪于570nm波长测A值。按下述公式计算NK活性，以杀伤率（%）表示。NK细胞活性（%）=[1（实验孔（效+靶）A值效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%　　1.2.5特异性细胞毒性（CTL）测定　　用MTT法检测，效应细胞为小鼠脾细胞，靶细胞为D5细胞，其余方法、步骤同上。同时用MGC803细胞（人胃癌细胞株）作为对照。　　1.3统计学分析样本均数采用成组资料方差分析，配对资料采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学

7、意义。　　2.2NK细胞活性末次免疫后3天及接种肿瘤后3周，各实验组小鼠脾NK细胞的杀伤活性均高于对照组小鼠(P<0.01)，但各实验组之间的杀伤活性无统计学差异（P>0.1）。实验组及对照组接种肿瘤后3周与末次免疫后3天的NK细胞活性比较略有降低，但无统计学差异，见表2。表2小鼠NK细胞活性（杀伤率%）(略)　　2.3特异性细胞毒（CTL）活性　　末次免疫后3天，各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率均高于对MGC803细胞杀伤率(P<0.05)，而对照组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率与对M

8、GC803细胞杀伤率比较差异无统计学意义（P>0.1）。并且各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率均高于对照组，其中A、B、D组较C、E组高(P<0.05)。接种肿瘤后3周，各实验组小鼠脾细胞对D5细胞杀伤率亦高于对MGC803细胞杀伤率(P<0.05)，且各实验组对D5细胞杀伤率均高于对照组(P<0.05)，此时各实验组间对D5细胞杀伤率基本相当（P>0.05）。各组接种肿瘤后3周对D5细胞的杀