高通量悬浮芯片技术检测多农兽药残留论文

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1、高通量悬浮芯片技术检测多农兽药残留论文刘楠苏璞朱茂祥杨陟华潘秀颉王红勇晁福寰高志贤【摘要】建立了一种同时可检测多农兽药残留的高通量悬浮芯片技术。以常用的7种农兽药为待测靶标物，通过优化条件，使抗原抗体基本完全反应，操作简便快捷，最多可同时检出7种农兽药残留靶标物;实验结果表明，高通量悬浮芯片检测标准回归曲线方程和相应的决定系数R2表现良好;在对含有多种农兽药残留的不同盲样的检测中，检测浓度值与实际浓度的相对偏差较小。高通量悬浮芯片技术为多农兽药残留的快速检测提供了新方法，此系统可用于多农兽药残留实际样品的初步检测.freelphenicol,CAP)等农兽药残留多采用色谱法2,3、色谱质谱联

2、用法4,5和酶联免疫吸附法(ELISA)6,7测定。色谱质谱联用法和色谱法虽然灵敏度高，但实验室条件要求高，检测方法复杂，费时费力，成本高;ELISA法每次只能检测一种靶标物，不能满足对多农兽药残留的高通量多元分析要求。因此，建立一种灵敏、快速、高通量的检测技术势在必行。悬浮芯片技术是美国Luminex公司开发的一种多功能的液相芯片分析平台，具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点;与固相芯片相比，液相芯片具有灵活性更好，可以根据需要调节每次检测所需要的微球的数量和调整检测体系的设计8。目前，对该技术的研究集中于检测大分子蛋白质和核酸9,10，本研究组曾采用悬浮芯片结合酶免疫法检测了3种兽药残

3、留11。本研究以常用的4种兽药(氯霉素、克伦特罗、雌二醇和泰乐菌素)和3种农药(阿特拉津、吡虫啉和甲萘威)共为靶标物，基于间接竞争法的免疫学检测原理，改进了常规悬浮芯片技术在微球上固定抗体的方法，根据待测靶标物灵活自由组合，可同时检出7种农兽药残留靶标物;本方法简便、快捷，降低了实验成本，结果稳定可靠，具有一定的实际应用价值。2实验部分2.1仪器与试剂BioPlexTM悬浮系统(美国BioRad公司);6930型冷冻离心机(日本KUBOTA公司);MS3Digital型旋涡混匀器(德国IKA公司);Costar96孔酶标板(美国Corning公司)。实验室偶联有7种农兽药蛋白结合物的不

4、同编码的羧基荧光检测微球11;蛋白氨基偶联试剂盒(美国BioRad公司)，内含激活缓冲液(ActivationBuffer);Ar、CAP、CL、吡虫啉(Imidacloprid,Im)、甲萘威(Carbaryl,Cbl)、雌二醇(17βestradiol,E2)和泰乐菌素(Tylosin,Tyl)均购于美国Sigma公司;链霉亲和素藻红蛋白(Strepavidinphycoerythrin,SAPE，美国Invitrogen公司);牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,.freelAb)和E2单抗(E2mAb)购自美国Biodesign公司;CL单抗(CLmAb

5、，英国Abcam公司);Ar单抗(ArmAb)和Im单抗(ImmAb)购自北京万华普曼生物工程有限公司;Tyl单抗(北京望尔生物工程有限公司);Cbl多隆抗体(CblpAb,中国农业大学许艇惠赠)。其它试剂均为国产分析纯。2.2实验方法2.2.1悬浮芯片反应抗体加入量的优化和筛选7种抗体各分别分为5个梯度加入，分别取出7种偶联过兽药结合物的微球2000个，每个梯度做3个平行样，根据检测所获得的中位荧光强度值(Medianfluorescentintensity,MFI)来确定最佳抗体加入量。以进入平台期拐点的抗体加入量为最适特异性生物素化抗体加入量。2.2.2农兽药残留多元分析的悬浮芯片

6、标准曲线绘制在96孔酶标反应板的各孔中分别加入优化后的7种农兽药靶标物对应的生物素化单抗，分别将这7种农兽药标准品梯度稀释加入。将微球等比例混合，每孔加入14000个(2000/种beads，共7种)，每孔用PBS缓冲液补足至50μL，同时准备一个不加任何标准品的阳性对照孔。37℃中速漩涡振荡1h，使微球上的靶标农兽药蛋白结合物与溶液中相应的标准品共同竞争生物素化单抗，然后每孔加适量SAPE，37℃中速振荡30min。悬浮芯片系统进行检测，获得MFI。以各种靶标标准品的浓度为横坐标，以检测得到的MFI为纵坐标，得7种农兽药的悬浮芯片高通量检测标准曲线。3结果与讨论3.1农兽药最适生物素化抗体

7、加入量的优化图17种生物素化农兽药抗体加入量和MFI的关系Fig.1Relationshipbetesofthesevenbiotinylatedantibodiesandmedianfluorescenceintensity(MFI)7种农兽药生物素化抗体在不同加入量时所获得的MFI如图1所示。实验表明，MFI值起初随抗体加入量增加而增大，到某一个拐点处进入缓慢增大或平台期;继续增大抗体加入量并