genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用论文

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1、Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用论文焦敏南克俊雷燕张茜孙海凤【摘要】目的：研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞株MDAMB231体外侵袭能力的影响并探讨其机制.方法：采用细胞体外侵袭实验系统，观察genistein对乳腺癌细胞体外侵袭能力的影响；应用MP2,MMP9蛋白表达的变化，采用明胶酶谱分析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的MMP2,MMP9活性进行分析.结果：在药物作用24，48，72h后，15μmol/L组和30μmol/L组侵袭至Matrilge

2、l滤膜下的细胞数分别为（245±12）个，（300±20）个，（378±18）个和（155±20）个.freelol/L组的MMP2蛋白相对值分别为0.71±0.07，0.32±0.06和0.12±0.03；MMP9的相对值分别为0.92±0.06，0.63±0.04和0.24±0.02.明胶酶谱分析结果显示，15，30μmol/L组基质金属蛋白酶活性显著降低(P0.05).结论：genistein有效抑制乳腺癌侵袭和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力，抑制MMP2，MMP9表达水平与

3、活性有关.【关键词】乳腺肿瘤；染料木黄酮；侵袭；基质金属蛋白酶类0引言金雀异黄素（genistein）是一种植物来源的异黄酮化合物，是大豆中重要的非营养成份，对人乳腺癌细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞具有体外抗增殖作用［1］，但有关genistein对乳腺癌侵袭转移作用的研究尚少见报道.本研究以人乳腺癌MDAMB231细胞株为研究对象，观察genistein对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制，为genistein应用于肿瘤临床治疗提供实验依据.1材料和方法1.1材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDA

4、MB231(美国模式菌种收集中心ATCC细胞库)；genistein，明胶（美国Sigma公司）；鼠抗人MMP2，MMP9mAb（北京中山生物工程公司）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Q550IEM培养液按1∶20稀释后，取100μL包被Transol/L，37℃孵育24，48，72h后，取出Transol/L，pH7.2PBS淋洗，棉签擦拭微孔膜上层，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于20g/L多聚甲醛中30min，Giemsa染色后进行

5、细胞计数.1.2.2DAMB231传代于100mm的培养皿中，待细胞贴壁后，分别加入浓度为0，15，30μmol/L的genistein，作用48h后，分别提取细胞总蛋白分析.细胞用冷PBS洗涤2次，用300μLRapa裂解液裂解细胞，细胞裂解物-80℃过夜，然后刮取细胞，以12000g，4℃离心15min，收集上清移入新的1.5mL离心管中，考马斯亮兰法定量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度，取20μg总蛋白进行100g/LSDSPAGE胶电泳，然后电转移至NC膜上.用含有50g/L去脂奶粉的TBS

6、T(TBS+1g/L吐温-20)封闭1.5h；分别加入一抗MMP2，MMP9mAb(各按1∶250稀释)，孵育2h，TBST漂洗30min；HRP标记羊抗鼠IgG孵育1h；TBST漂洗30min；ECL显色.同时以βactin蛋白为内参照.EM培养基培养长至60%密度时，镜下观察见细胞贴壁良好，以无血清DMEM洗3遍，每孔再加入DMEM(无血清，含有不同浓度genistein)1mL，继续孵育48h，收集培养上清液并活细胞计数，以3000r/min，离心5min去除细胞碎片，以细胞数为依据调整体

7、积，分装后立刻进行酶谱分析或冻存于-80℃备用.1.2.4明胶酶谱活性分析将细胞条件培养液上样于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶(胶中含1g/L的明胶，明胶是IV型胶原酶底物)，4℃条件下，浓缩胶90V，分离胶140V恒压电泳，电泳后，将凝胶于含有25mL/LTritonX-100的洗脱液内振摇洗涤3次，每次30min.孵育液(50mmol/LTriscl，5mmol/LCaCl2，0.2g/LZnCl2，pH7.5)内37℃孵育18h；1g/L考马斯亮蓝R250染色，300mL/L甲醇、100mL

8、/L乙酸脱色，干燥保存.为了尽量避免误差，每组细胞均设3个以上平行样本，并经多次重复实验.1.2.5计算机图像分析运用德国产LEICAQ550IDAMB231细胞侵袭能力的影响侵袭实验结果显示，实验组与对照组细胞均能够侵袭至铺有Matrigel滤膜上（图1）.24，48，72h3个时间点上的侵袭细胞数，genistein15μmol/L组为（245±12）个，（300±20）个，（378±18）个；30μmol/L组为（155±20）个