外周血单个核细胞hbv的复制状态与干扰素

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1、外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素作者：陈天艳，陈瑞琳，蔺淑梅，叶峰，张曦，陈云茹，赵英仁，张树林【摘要】　　目的:研究HBV侵犯外周血单个核细胞（PBMC）及对IFN-γ表达和分泌的影响.方法:慢性HBV感染者60例，巢式PCR检测PBMC中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）；ELISA法检测血清IFN-γ水平；实时定量RT-PCR方法检测PBMC中IFN-γmRNA的表达水平.结果:48.3%（29/60）的患者PBMC中检测到cccDNA；血清IFN-γ水平低于对照组（P＜0.05）；PBMC中IFN-γmRNA表达水平低于对照组（P＜0.01）；PBMC中c

2、ccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于cccDNA阴性组（P＜0.01）.结论：HBV慢性感染者PBMC中IFN-γ表达和分泌水平降低.【关键词】肝炎病毒乙型DNA环状外周血单个核细胞干扰素Ⅱ型　　【Abstract】AIM:Tostudyhoplifiedbynest-PCR.ThelevelofIFN-γintheseruminedbyELISA.TheexpressionofIFN-γmRNAinPBMCinedbyreal-timeRT-PCR.RESULTS:HBVcccDNAinPBMCinedby48.3%（29/60）inpatients.Theserum

3、levelofIFN-γinthepatientsonocytes;interferontypeⅡ　　0引言　　HBV感染慢性化是机体免疫功能紊乱，主要是细胞免疫功能低下所致，Th1/Th2细胞亚群的失衡与HBV持续感染密切相关.IFN-γ主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生，可通过多种途径直接或间接促进Th1应答，提高细胞毒性T细胞（CTL），自然杀伤细胞（NK），单核-巨噬细胞活性，在清除HBV感染的细胞免疫反应中发挥着重要作用.IFN-γ活性水平直接反映了Th1细胞的功能，与HBV感染后的最终结局密切相关.因此，在证实HBV侵犯PBMC基础上，我们进一步比较慢性HBV感染

4、者PBMC中cccDNA阳性和阴性组IFN-γ表达和分泌水平，以了解HBV侵犯PBMC并在其中复制对免疫细胞功能的影响.　　1材料和方法　　1.1材料2007-01/2007-05慢性HBV感染者60(男43，女17)例，年龄15～52（平均34.7）岁.诊断标准符合2000年制定的《病毒性肝炎防治方案》标准.所有患者均排除HAV，HCV，HDV，HEV，柯萨奇病毒等感染和药物、酒精等其他原因造成的肝脏损害.健康对照者30例，均来自西安市健康献血员.无菌采集未抗凝静脉血2mL,-4℃离心后立即分离血清，-20℃冻存；肝素抗凝静脉血10mL，常规密度梯度法分离淋巴细胞，洗涤细胞5

5、次，分别收集第5次洗液和细胞.将细胞分2份，一份-70℃保存，用于检测乙肝病毒核酸；另一份按1×1010/L细胞密度加入1mLTrizolReagent，-70℃冻存，用于提取总RNA.TrizolReagent(美国invitrogen公司),绿豆芽核酸酶（MBN）（美国Promega公司）,HighPureViralNuclEicAcid试剂盒（Roche公司）,Rer-vertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas公司),HumanIFN-γELISAKit(美国Bender公司),扩增引物均由大连Takara公司设计和合成.

6、　　1.2方法用HighPureViralNuclEIcAcid试剂盒提取PBMC中病毒核酸.MBN反应体系：10×缓冲液1μL；8.33nkatMBN1μL；HBV核酸样品5μL；纯水补足体积至10μL.37℃孵育5min后立即置于冰水浴中，加1mol/LTris-Cl(ph8.0)2μL终止反应，总体积12μL.HBVcccDNA引物设计参照参考　　A：首轮PCR.3：阳性对照，5～6：阴性、空白对照；1～2标本；B：次轮1：阳性对照；2，5：阴性、空白对照；4：标本.　　图1PBMC中cccDNA电泳图（略）　　2.2血清中IFN-γ水平慢性HBV感染者血清IFN-γ水平

7、低于对照组（t=3.572，P＜0.05）；PBMC中IFN-γmRNA表达水平低于对照组（t=2.734，P＜0.01，表1）.　　表1慢性HBV感染者PBMCs分泌IFN-γ水平（略）　　aP＜0.05,bP＜0.05vs对照.　　2.3PBMC中cccDNA和IFN-γ表达和分泌的关系慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于阴性组（t=2.256，P＜0.01,表2）.　　表2慢性HBV感染者PBMC中cccDNA和IFN-γ表达和分泌水平（略）　　bP