衰老对小鼠骨髓造血干细胞影响的实验研究论文

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1、衰老对小鼠骨髓造血干细胞影响的实验研究论文高冬林薇林久茂郑良朴陈旭征宋军陈可冀【摘要】目的观察机械刺激下，衰老对小鼠骨髓造血干细胞的数量、表型、细胞周期和集落形成能力的影响。方法分离老年和幼年昆明小鼠的骨髓造血干细胞，进行细胞计数；流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期；并采用甲基半固体培养基检测集落的形成。结果两组小鼠骨髓单核细胞和悬浮细胞数量无显著差异，但幼年组细胞Sca1和CD34的表达较高，体外培养时易形成集落，且CFUMix集落产率较老年组有显著差异，说明机械刺激易激活幼年小鼠骨髓中的造血干细胞，使其数量增多.freel

2、IL3)10μg/L、重组鼠干细胞集落刺激因子(rmSCF)50μg/L、重组白细胞介素6(rhIL6)10μg/L、重组人促红细胞生成素(rhEPO)3kU/L、重组人胰岛素（rhInsulin）10mg/L〕(StemCellTech公司);小鼠淋巴细胞分离液(密度1.090，中国医学科学院生物医学工程研究所)；CycleTESTTMplusDNAREAGENTKIT（BD公司）。1.4实验方法1.4.1小鼠骨髓造血干细胞的分离培养参照Pereira〔4〕方法，将小鼠脱臼处死后置于75%酒精浸泡约5min，无菌条件下分离

3、出小鼠的股骨。尽量去除骨表面附着的组织，吸取10mlIMDM培养液,.freell的淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)，以1000r/min离心5min形成细胞沉淀，去上清液后重新制备细胞悬液，以1×106个细胞/ml的密度接种于含10%胎牛血清和10%马血清的IMDM培养基（含青、链霉素各100U/ml）中，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，48h后收集非贴壁的悬浮细胞进行下列实验。1.4.2细胞计数用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，采用细胞计数板常规计数。1.4.3细胞分裂周期的检测吸取100μl细胞悬液（细胞浓

4、度≥1×106个/ml），加入250μlA液，混匀后室温静置10min，加入200μlB液，轻轻混匀，再次室温静置10min，加入200μlC液混匀，低温（2～6℃）避光10min后，上机待检。利用CellQuest软件获取数据，ModiFit分析。1.4.4造血干细胞表型Sca1和CD34的检测分别吸取100μl细胞悬液(细胞浓度≥1×106个/ml)，各加入10μl大鼠抗小鼠Sca1或CD34抗体，同时做阴性对照，室温避光孵育20min，溶红细胞处理仪机洗后，重新悬浮，上机待检。1.4.5集落形成的检测将造血干细胞悬液以

5、1×104密度接种于甲基半固体培养基中，5%CO2、37℃饱和湿度下培养7d，任选6个视野计数爆式红系集落形成单位（BFUE），培养15d任选6个视野计数粒巨噬细胞混合集落形成单位（CFUMix）。CFUMix以40个以上细胞组成的细胞团为一个集落；BFUE以50个以上细胞组成的细胞团为一个集落。1.5统计学处理计量资料以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件包进行组间t检验。2结果2.1两组小鼠骨髓单核细胞总量和悬浮细胞数量的比较两组间小鼠骨髓单核细胞总量以及非贴壁细胞数量无显著差异（P＞0.05），但老年组单核细

6、胞总量和悬浮细胞的数量有下降的趋势（表1），且老年小鼠的单核细胞在培养过程中不容易形成集落。2.2两组集落形成的比较培养7d后，老年组BFUE集落产生量有下降的趋势；培养15d后，老年组CFUMix集落产率显著低于幼年组（P＜0.05）（表1）。2.3两组小鼠骨髓造血干细胞的分裂增殖能力的比较流式细胞仪检测结果表明，老年组和幼年组细胞DNA二倍体百分率分别为10.24％，18.84％（表2）。说明老年组细胞在机械刺激下的增殖能力较弱。2.4两组小鼠造血干细胞表型CD34及数量比较流式细胞仪检测结果表明，老年组非贴壁细胞中Sc

7、a1和CD34表达阳性率较幼年组明显降低（表2），说明老年组细胞中造血干细胞的数量减少。表1衰老对单核细胞数量和集落形成的影响表2衰老对机械刺激下造血干细胞表型和增殖能力的影响3讨论造血干细胞在生物个体的一生中承担起产生所有血细胞的功能，在小鼠个体生长过程中，造血的主要部位不断改变，最早在卵黄囊，随后在中胚层、胎肝，最后在骨髓。而且随着个体的生长发育，干细胞的表型和功能也会发生变化。Sca1和CD34是原始造血干细胞的表面标志，其中CD34＋的造血干细胞不仅参与鼠类长期的造血重建，而且能提高遭致死剂量辐射的小鼠存活率〔5〕，

8、另外，造血干细胞上CD34的表达随小鼠的成熟而逐渐下降〔6〕，小鼠胎肝中所有的造血干细胞都表达CD34，幼年鼠骨髓中只有50％造血干细胞表达CD34〔7〕，而成年小鼠中约90％的造血干细胞不表达CD34〔8〕。胎肝造血干细胞的植入活性和分化成淋巴细胞的潜力超过了