衰老对小鼠骨髓造血干细胞影响的实验研究

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1、衰老对小鼠骨髓造血干细胞影响的实验研究：高冬林薇林久茂郑良朴陈旭征宋军陈可冀【摘要】目的观察机械刺激下，衰老对小鼠骨髓造血干细胞的数量、表型、细胞周期和集落形成能力的影响。方法分离老年和幼年昆明小鼠的骨髓造血干细胞，进行细胞计数；流式细胞仪检测细胞表型和细胞周期；并采用甲基半固体培养基检测集落的形成。结果两组小鼠骨髓单核细胞和悬浮细胞数量无显著差异，但幼年组细胞Sca1和CD34的表达较高，体外培养时易形成集落，且CFUMix集落产率较老年组有显著差异，说明机械刺激易激活幼年小鼠骨髓中的造血干细胞，使其数量增

2、多，增殖能力增强。结论衰老影响小鼠骨髓中造血干细胞对机械刺激的反应，降低其数量、功能和增殖能力。【关键词】衰老；造血干细胞；骨髓成年个体组织中，细胞损伤和细胞更新这一自我平衡的过程主要靠组织特异的干细胞来实现的，干细胞功能障碍可能在衰老过程中发挥了关键作用〔1～3〕，致使衰老的机体丧失维持自我平衡能力或损伤后无法恢复自我平衡能力，最终导致功能的全面退化。阐明衰老过程中干细胞的变化，对于再生医学中应用干细胞进行损伤修复，治疗退行性疾病及其衰老导致的功能退化有重要意义。高龄会造成血液和淋巴系统中T淋巴细胞和B淋巴细胞

3、生成量减少，导致免疫力下降和老年人易发白血病等诸多变化，而所有的血细胞都是由造血干细胞分化得到的，提示衰老会对造血干细胞产生影响。为了探讨衰老对小鼠骨髓造血干细胞的影响作用，本文开展了相关研究，并得到一些初步的结果，现报道如下。1材料与方法1.1动物分组及处理老年昆明小鼠，20月龄，体重(55±5)g；幼年昆明小鼠，1月龄，体重(20±5)g，由福建中医学院实验动物中心提供，雌雄不限，分老年组、幼年组，每组6只。小鼠按体重常规灌胃给予生理盐水，每天1次。第8天处死小鼠进行骨髓造血干细胞的分离提取。1.2仪器倒置式

4、系统显微镜IX70（OLYMPUS公司，配备同公司的数码摄像装置），流式细胞仪FACSCalibur(BD公司)，溶红细胞处理仪(BD公司)，CO2培养箱（Heraus）,超净工作台（苏州净化设备公司）。1.3试剂IMDM培养基（均购自Hyclone公司），优质胎牛血清（BIOCHROMAG公司）,FITC标记的大鼠抗小鼠CD34、阴性对照大鼠IgG2aPE(Serotec公司）和IgG2aFITC（Serotec公司），PE标记的大鼠抗小鼠Sca1（Biolegend公司）和小鼠早期造血细胞甲基半固体长期

5、培养基MethoCultTMGFM3434〔含重组小鼠白细胞介素3(rmIL3)10μg/L、重组鼠干细胞集落刺激因子(rmSCF)50μg/L、重组白细胞介素6(rhIL6)10μg/L、重组人促红细胞生成素(rhEPO)3kU/L、重组人胰岛素（rhInsulin）10mg/L〕(StemCellTech公司);小鼠淋巴细胞分离液(密度1.090，中国医学科学院生物医学工程研究所)；CycleTESTTMplusDNAREAGENTKIT（BD公司）。1.4实验方法1.4.1小鼠骨髓造血干细胞的分离培养参

6、照Pereira〔4〕方法，将小鼠脱臼处死后置于75%酒精浸泡约5min，无菌条件下分离出小鼠的股骨。尽量去除骨表面附着的组织，吸取10mlIMDM培养液,用针头在股骨干骺端钻孔,从股骨一端冲洗骨髓腔，将骨髓细胞吹到培养皿内,用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液,150目铜网过滤,收集过滤的细胞悬液，用密度为1.090g/ml的淋巴细胞分离液分离单个核细胞(MNC)，以1000r/min离心5min形成细胞沉淀，去上清液后重新制备细胞悬液，以1×106个细胞/ml的密度接种于含10%胎牛血清和10%马血清的IMDM培养基

7、（含青、链霉素各100U/ml）中，置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，48h后收集非贴壁的悬浮细胞进行下列实验。1.4.2细胞计数用吸管反复轻柔吹打制成单细胞悬液，采用细胞计数板常规计数。1.4.3细胞分裂周期的检测吸取100μl细胞悬液（细胞浓度≥1×106个/ml），加入250μlA液，混匀后室温静置10min，加入200μlB液，轻轻混匀，再次室温静置10min，加入200μlC液混匀，低温（2～6℃）避光10min后，上机待检。利用CellQuest软件获取数据，ModiFit分析。1.4.4造血

8、干细胞表型Sca1和CD34的检测分别吸取100μl细胞悬液(细胞浓度≥1×106个/ml)，各加入10μl大鼠抗小鼠Sca1或CD34抗体，同时做阴性对照，室温避光孵育20min，溶红细胞处理仪机洗后，重新悬浮，上机待检。1.4.5集落形成的检测将造血干细胞悬液以1×104密度接种于甲基半固体培养基中，5%CO2、37℃饱和湿度下培养7d，任选6个视野计数爆式红系集