蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究论文

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1、蜂胶体外诱导喉癌细胞凋亡的实验研究论文王菊香，郑海萍，裴士庚，门金娥，张向阳【摘要】目的探讨蜂胶对喉癌细胞珠Ｈep-2凋亡的影响及作用机制。方法用流式细胞仪、原位末端标记法、激光共聚焦显微镜等技术，观察蜂胶对细胞的抑制、凋亡情况及细胞内Ca2+变化。结果蜂胶能抑制Hep-2细胞的生长、诱导喉癌细胞凋亡，非特异性地阻滞Hep-2细胞周期的全过程。原位末端标记检测出细胞凋亡率亦有时间、剂量依赖性。细胞内Ca2+随蜂胶浓度的增加而升高，且具有统计学意义。结论蜂胶能够抑制喉癌细胞生长.freelg/ml。1.2试剂及仪器RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产

2、品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BECTONDICKINSON公司产品；POD试剂盒购自华美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦显微镜（BIO-RAD公司产品）。1.3细胞株人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉头颈外科实验室惠赠。2方法2.1蜂胶浓度分组实验前用RPMI1640(Gibco公司)将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160μg/ml，DMSO的浓度低于0.02%。2.2流式细胞仪检测收集对照组和80μg/ml蜂胶作用不同时间(24，48，72h)的细胞，用PBS洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1h以上，上机前加1

3、800μl胰酶消化液充分作用，加入1500μl碘化丙啶(PI)作用15min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析。2.3原位末端标记法(TUNEL)定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，72h收集细胞，PBS洗2次，细胞涂片，室温干燥。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通光镜计算凋亡率(AI)。计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。2.4Hep-2细胞内Ca2+变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期Hep-2细胞，用D-Hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下Fluo

4、-3/AM（10μmol/L）荷载。40min后用D-Hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料，最后保留少许细胞外D-Hanks缓冲液，平衡10min。经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488nm，发射波长526nm，以本底荧光强度为参照（0），检测细胞内Ca2+荧光强度。2.5数据统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验。α=0.050。3结果3.1流式细胞仪检查结果80μg/ml蜂胶对Hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，72h时Hep-2细胞抑制率分别为3

5、6.2%，44.5%，58.6%，时间越长细胞凋亡率越高（P0.05）。24，48，72h时G0/G1期细胞分别占67.2%，55.8%，59.4%；S期分别占19.1%，28.3%，33.5%；G2/M期分别占13.7%，15.9%，7.1%。3.2TUNEL标记各组细胞凋亡率明显升高，与同时间对照组比较差异有显著性，且呈现一定的时间、剂量依赖性。见表1。表1不同浓度、不同时间蜂胶作用的Hep-2的细胞凋亡率比较（略）与对照组比较，*P0.05，**P0.01，各时间组、各剂量组相关系数r经检验，P0.013.3Hep-2细胞内Ca2+的变化结果见表2。

6、随药物浓度的增加，不同浓度组之间的细胞内Ca2+荧光强度亦增高。P0.05。表2两组不同时点Hep-2细胞内Ca2+荧光强度比较（略）4讨论蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽及树干上采集的树脂，并混入其上腭腺分泌物、蜂蜡和少量的花粉加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。目前，已知蜂胶中所含抗癌有效成分有：黄酮类、萜烯类、多糖物质、酯类化合物等及其他化合物的天然组合，它们之间相互协调作用，赋予了蜂胶的抗癌作用［1］。实验表明，蜂胶可抑制由化学致癌物诱发的基因突变［2］。由于放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤机体的免疫活性细胞及造血细胞，因此，强化机体免疫、对抗放

7、疗、化疗引起的副作用，是当今肿瘤防治工作重要任务之一。大量研究表明，蜂胶是一种天然的免疫强化剂，同时又兼有抗肿瘤、抗病毒、抗菌的活性［3］。本实验表明蜂胶对Hep-2细胞具有明显的抑制作用，可诱导Hep-2细胞凋亡，且对细胞周期有一定的影响，既可影响细胞周期G1期向S期转变，又可影响S期向G2M期的转变过程，导致肿瘤细胞凋亡，非特异性阻滞细胞周期的全过程。在此基础上，用TUNEL法定量观察蜂胶诱导Hep-2细胞凋亡的规律。Hep-2细胞有一定的自然凋亡率，但蜂胶组中的阳性细胞数明显多于对照组，且具有时间、剂量的依赖性。随着蜂胶浓度的增加，对癌细胞的杀伤作用

8、也在增强。Ca2+信号传导在细胞凋亡机制研究中的作用日益受到人们重