cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化_论文

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1、CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化【关键词】CGGBP1；基因表达；纯化　0引言脆性X综合征（fragileXsyndrome,FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragileXmentalretardation,FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致.FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］.本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1基因5′d(CGG)n3′重复序列特异

2、性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法材料大肠杆菌DH5α,BL21（DE3）和表达载体pRSETA均为本实验室保存.质粒提取试剂盒购自Sigma公司；限制性内切酶BamHI和KpnI购自宝生物工程公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.8/8方法表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGG

3、BP1FCGCGGATCCGAGCGATTGTAGTAACAGCA，CGGBP1RGGGGTACCTCAACAATCTTGTGAGTTGAG.其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分).PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列.设计PCR扩增体系25μL，灭菌去离子水10μL，10×反应缓冲液μL，25mmol/LMgCl2μL，DMSOμL，4×dNTP混合物（每种mmol/L）2μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10pmol，模板μL（5

4、0ng/μL），TaqDNA（5μ/μL）聚合酶μL.扩增条件：95℃预变性5min，再94℃30s，53℃1min，72℃1min循环40次，最后72℃终末延伸产物10min.PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因.用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSETA，酶切产物电泳后回收，在Ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSETA的BamHI和KpnI克隆位点.将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（DE

5、3）.挑取携带目标质粒的单菌落接种于含1008/8mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12h，按10mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，32℃诱导振荡培养4h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5mL菌液离心，用500μL的裂解液（10mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl及50mmol/L磷酸二氢钠pH）重悬，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰浴30min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDS

6、PAGE分析.融合蛋白的纯化将1mL500mL/LNi2+NTA悬液和4mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60min，直接过柱.过柱结束后，用4mL漂洗液（20mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl及50mmol/L磷酸二氢钠pH），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白.经过2次漂洗后再用mL洗脱液(250mmol/L咪唑，300mmol/LNaCl及50mmol/L磷酸二氢钠pH)3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集.取收集液，进行SDSPAGE分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10μL磁珠用1mL

7、的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂.1×生物素亲和素结合缓冲液（10mmol/LTrisHCl，2mol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1g/L8/8Tween20）15μL重悬磁珠，各5μL分3组实验.其中一组加入25μL（100ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25μL（100ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30μL，25℃轻摇1h.经磁力吸附后，弃上清.重复上述步骤3次

8、；加入纯化后CGGBP1（500μg/mL）15μL和2×核酸蛋白结合缓冲液（20mmol/LHEPES，100mmol/LNaCl，mmol/LDTT，100g/L甘油）20μL，室温下静置30min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10μL，沸水煮10min，进行SDSPAGE分析.　　2结果原核表达载