异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验

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1、异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验【摘要】探讨大鼠异体树突状细胞融合瘤苗诱导的抗骨肉瘤免疫学效应。方法采用R106通过电穿孔的方法进行融合。经分离纯化后，分别与SD、TT法测定细胞毒T淋巴杀瘤活性。结果T淋巴细胞和异体融合瘤苗经过共同培养，T细胞得以显著增殖。异体瘤苗诱导的UMR106特异性CTLs杀瘤效果显著，该效应是由MHCⅠ限制的CD8+细胞发挥作用。结论异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗具有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性CTLs的潜能，为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略，有望在临床骨肉瘤

2、患者中获得广阔的应用前景。【关键词】树突状细胞骨肉瘤融合瘤苗免疫治疗0引言瘤苗作为肿瘤特异性主动免疫治疗方式，目的是激发启动、调节增强机体固有的免疫功能和抗癌能力以维护机体生理平衡。它具有使机体由被动抗癌向主动抗癌转变的特点。目前瘤苗制备中抗原负载的方法种类繁多，其中通过细胞融合技术将肿瘤细胞与抗原呈递细胞（Antigenpresentingcells,APCs）穿孔融合制成的融合瘤苗，被认为是最具可行性及临床应用价值的一类。在当前瘤苗的临床应用中，自体瘤苗的成功制备通常会受到疾病本身的困绕。而异体的树突状细胞可以从储备的健康

3、志愿者外周血单核细胞获得，又可避免使所有肿瘤患者在接受免疫治疗前都必须提供相当量的自身外周血的缺陷，避免了“雪上加霜”[13]。本研究中，作者应用R106通过电融合的方法进行细胞融合，制备异体融合瘤苗（DC/osteosarfusioncells,DOF），诱导T淋巴细胞增殖及骨肉瘤特异性CTLs。1材料与方法1.1材料4～6周龄雄性SD、R106购自美国ATCC（AmericanTissueCultureCollection）。1.2主要仪器和试剂MiniMACS磁性分离仪为德国MiltenyiBiotecGmbH公司

4、产品；流式细胞仪为美国BDPharMingen公司产品；细胞融合仪为美国BTX公司的2001型产品；酶联免疫分析仪为芬兰Labsystem公司产品；rGMCSF、rIL4、rTNFα购自R＆D公司；FITC标记抗大鼠MHCⅠ、MHCⅡ、FITC标记抗大鼠CD4、CD8、FITC标记抗大鼠CD44、PE标记抗大鼠OX62、PE标记抗大鼠CD80、CD86购自英国Serotec公司；小牛血清和RPMI1640培养基为美国HyClone公司产品；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司。1.3细胞培养与融合1.3.1I

5、1640，将其针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓直至骨变白，收入50ml离心管中，1500r/min离心收集骨髓细胞，弃上清，沉淀细胞用5ml无血清RPMI1640重悬，再经淋巴细胞分离液密度梯度离心，初步纯化单个核细胞(Bonemarroononuclearcells，BMMCs)，离心洗涤2次，收集沉淀的骨髓细胞。1.3.2DCs的培养扩增及鉴定方法见2.2异体融合细胞DOF的表型检测R106骨肉瘤细胞以5∶1的比例混合后，加入细胞融合仪的电击槽，细胞在融合电压作用下发生了细胞膜之间的融合。MiniMACS分离柱筛

6、选后的DOF，经双色荧光标记流式细胞术检测，CD44（FITC）和OX62（PE）双阳性细胞比例为49.43％，见图1。UMR106（左），DCs（中），和DOF（右）表面antiratCD44（FITC）和antiratOX62（PE）检测结果图1双色荧光标记流式细胞术对UMR106，DCs和DOF进行表型检测2.3DOF刺激T淋巴细胞增殖效应以未加刺激细胞组作为空白对照。结果显示，DOF具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的功能。在SD大鼠骨髓来源的T细胞组，DOF在各浓度的刺激指数（SI=加刺激细胞孔OD值/不加刺激细胞孔O

7、D值）均高于未融合的DCs和UMR106，具有显著性差异（P<0.05），SI随刺激细胞与反应细胞比例增加而升高，见图2。而在R106的SI之间没有统计学差异（P>0.05），各浓度DOF和UMR106的SI均显著高于DCs的SI（P<0.05）,见图3。UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UMR106与DCs经电融合获得的异体融合细胞图2DOF刺激SD大鼠T淋巴细胞增殖能力UMR106：大鼠骨肉瘤细胞系；DCs：未加抗原致敏的树突状细胞；DOF：骨肉瘤细胞UM

8、R106与DCs经电融合获得的异体融合细胞图3DOF刺激TT法检测不同效靶比效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，结果显示：在SD大鼠骨髓来源的T细胞SD大鼠的T细胞组，CD8+细胞比例由诱导前的34.16%升高到74.85%；CD4+细胞比例由诱导前的59.19%降低到19.05%