小鼠树突状细胞与骨髓瘤细胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效应研究

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1、万方数据AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofmasterImmunologicaleffectofexosomesderivedfromDC／sp2／0fusionvaccineByGuanShashaSupervisor：Prof．DuYingXuanXiaoyanDepartmentofMicrobiologyandImmunologyBasicMedicalCollege，ZhengzhouUniversityMay2014万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研

2、究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：冶畜眵日期：．九，“年占月，>曰学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发

3、表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：I雍谚多日期：如，少年多月，≥日万方数据摘要小鼠树突状细胞与骨髓瘤细胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效应研究研究生管莎莎导师杜英轩小燕郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室郑州450001目前肿瘤治疗方法主要有手术、化疗、放疗和生物治疗。其中肿瘤生物治疗是目前研究的热点，具有良好的前景，树突状细胞(DendriticCell，DC)是肿瘤生物治疗的重点研究对象。树突状细胞是目前己知功能最强的抗原提呈细胞(AntigenPresentingCell，AP

4、C)，其在肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题将DC与肿瘤细胞融合制成瘤苗，使该融合细胞即表达肿瘤抗原又具有提呈抗原的能力。Exosomes为一种直径30—120nm大小的囊泡状物质，其中含有核酸和蛋白质。多种细胞已经被证实在体外都能向细胞外释放exosomes，包括：多种血细胞(B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞，血小板)、肠上皮细胞、施万细胞(schwann，又名雪旺细胞)、脂肪细胞、神经细胞、纤维母细胞和多种肿瘤细胞系【37411。目前在临床和实验研究中具有抗肿瘤作用的exosomes主要有两种，一是肿瘤细胞产生的exosomes(TumorDerivedExosomes，TEX)

5、，因其含有许多肿瘤细胞所共有的肿瘤抗原，具有潜在的加强肿瘤细胞免疫原性、促进抗肿瘤免疫的作用142J；二是DCs来源的exosomes(DendriticCellsDerivedExosomes，DEX)。也有研究表明，某些肿瘤细胞和不成熟树突状细胞来源的exosomes不能有效增强机体免疫，甚至具有免疫耐受作用。因此，exosomes是否具有抗肿瘤免疫效应，不仅与其来源细胞的特点和功能状态有关，也需要对获得的exosomes进行体内外试验进行功能验证。考虑到DC细胞的抗原提呈能力和肿瘤细胞易增殖的特点，有研究者采用杂万方数据摘要交瘤技术将DC与骨髓瘤细胞融合制成瘤苗，即克服了DC细

6、胞分离提取和培养困难的问题，也克服了肿瘤细胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱点，在体内外研究上都显示出了抗肿瘤效应。但该融合细胞分泌exosomes是否具有融合细胞膜标志的特点、是否具有抗肿瘤作用，报道尚少。本文将骨髓瘤细胞和DC融合，再提取融合细胞分泌的exosomes，进行抗肿瘤效应研究。目的为获得理化性质稳定、耐高温、制各时可质控，较细胞性瘤苗更具优越性的肿瘤治疗疫苗，本文通过收集DC／J]中瘤细胞融合细胞上清液，分离提取exosomes，并对其进行鉴定和抗肿瘤效应研究，以期为DC／肿瘤细胞融合疫苗的应用开辟新的途径。方法1．DC的提取和培养：取6．8周BALB／c雄性小鼠，无菌

7、分离股骨、胫骨和腓骨，髓腔冲洗获得骨髓细胞，静置24h，去除未贴壁细胞，将贴壁细胞培养于含lO％]]fi牛血清DMEM(Dulbecco’SModifiedEagleMedium)培养液中，加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophageColony．StimulatingFactor，GM．CSF)20ng／ml，自细胞介素一4(Interleukin4，IL一4)10ng／ml，诱导其向DC分化。2．骨髓瘤sp2／0细胞培养