西花蓟马的scar 分子检测技术

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西花蓟马的SCAR分子检测技术孟祥钦1，闵亮1,3，万方浩1,2，周忠实1,2，王文凯3，张桂芬1,2,基金项目：国家“973”计划项目（2009CB119200）；国家科技支撑计划项目（2006BAD08A14）；公益性行业（农业）科研专项（200803005）；国家自然科学基金项目（30971967）；中央财政国家重点实验室自主研究课题专项经费（SKL2007SR04）作者简介：孟祥钦，男，1983年12月生，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向为入侵生物学与分子生态学，E-mail:mengxiangqin2003@163.com*通讯作者AuthorforcCorrespondenceingauthor,E-mail:guifenzhang3@mail.caas.net.cn收稿日期Received：2009-11-25；接受日期Accepted：2010-01-31(1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193；2.农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京100081；3.长江大学农学院，湖北荆州434025)摘要：西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是一种世界性入侵害虫，寄主范围广，危害严重，2003年首次在我国发生危害，并有进一步扩散蔓延的趋势。针对蓟马类害虫虫体微小、形态相似，难以准确快速区分的问题，采用特征序列扩增区域（SCAR）标记技术，以西花蓟马及与之同域发生的其他种类蓟马为对象，筛选出1对西花蓟马特异性引物（FOMF/FOMR），其扩增片段大小为320bp。种特异性检测结果显示，该对引物只对西花蓟马的基因组DNA具有扩增能力，对同域发生的花蓟马F.intonsa(Trybom)、禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)、烟蓟马ThripstabaciL.等41种蓟马不具有扩增效果。该对引物不仅对不同虫态的西花蓟马具有扩增能力，而且在西花蓟马发生地的寄主植物组织内亦检测到了其卵的存在。同时，该检测技术灵敏度高，对成虫的最低检出阈值为1/160头。本检测技术在口岸检疫以及花卉、蔬菜和种苗调运中的害虫检测和监测中具有重要意义。关键词：西花蓟马；RAPD-PCR；SCAR；快速检测；特异扩增；检出阈值中图分类号:Q966文献标识码:A文章编号:0454-6296(2010)03-0000-00SCARmarkerforrapididentificationofthewesternflowerthrips,Frankliniellaoccidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)MENGXiang-Qin1,MINLiang1,3,WANFang-Hao1,2,ZHOUZhong-Shi1,2,WANGWen-Kai3,ZHANGGui-Fen1,2,*(1.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China;2.CenterforManagementofInvasiveAlienSpecies,MinistryofAgriculture,Beijing100081,China;3.AgricultureCollege,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei434025,China)Abstract:Thewesternflowerthirps,Frankliniellaoccidentalis(Pergande),isaworldwidepest,causingseriousdamagetoawiderangeofhostplants.ItwasfirstreportedinChinain2003,withatrendoffurtherspreading.Mostofthripsspeciesaresmallinsizeandsimilarinmorphology,whichmakesithardtobedistinguishedquickly.Inthepresentresearch,apairofSCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)primers(FOMF/FOMR)whicharespecifictowesternflowerthripswasdevelopedbyusingotherninefamiliarthripsspeciesasthecontrol.ThefragmentamplifiedbytheprimersFOMF/FOMRwas320bpinlength.SpecificitytestsperformedwiththispairofprimersshowedthatallF.occidentalisspecimensweredetectedpositivelyandnocrossreactionswithother41thripsspecies,includingF.intonsa(Trybom),F.tenuicornis(Uzel)andThripstabaciL.,weredetected.Themethodwastestedonasinglemaleandfemaleadult,asinglepre-pupaandpupa,asinglefirst1st-andorsecond2nd-stageinstarlarva,eandevenasingleegg,andprovedtobeapplicableforthese stagesofF.occidentalis.Moreover,the320bpgenomicDNAfragmentwasclearlyidentifiedinthehostplanttissuescollectedinF.occidentalisinfestedareas.Whenthedilutionwas1/160ofawholefemaleadultofF.occidentalis,the320bpDNAfragmentcouldbeidentifiedforallreplicates.Ourpresentresultsindicatethatthetechniqueisusefulinquarantineatportsandinpestdetectionandmonitoringduringtransportationofflowers,vegetablesandseedlings.Keywords:Frankliniellaoccidentalis;RAPD-PCR;SCARmarker;rapiddetection;specificamplification;detectablethresholdlimitvalue西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属的一种重要害虫，自20世纪40年代即对美国西部的花卉产业造成巨大的危害(Bailey,1940)，近30年来，随着国际贸易活动的日益频繁，西花蓟马迅速传播扩散，已成为世界性入侵害虫(KirkandTerry,2003)。我国于2000年首次在昆明国际花卉节参展的缅甸盆景上截获西花蓟马(蒋小龙等,2001)，2003年在北京温室的辣椒上发现其为害(张友军等,2003)，随后在云南(徐家菊和韦丽莉,2005)、山东(郑长英等,2007)等地亦发现其为害。程俊峰等(2006)采用CLIMEX软件，结合我国634个气象站点的数据，对西花蓟马在我国的潜在适生区进行了预测，结果显示，西花蓟马在我国具有广泛的适生区。即使在非适生区，随着温室、大棚等设施农业的快速发展，西花蓟马的发生也会成为可能。西花蓟马的寄主范围十分广泛，包括菊科、葫芦科、茄科、豆科、十字花科等在内的62科，500多种植物，基本涉及所有的开花植物(Yudinetal.,1986;Moritz,2002)。西花蓟马的为害方式主要有两种：一是以锉吸式口器直接取食为害，降低产量，使花卉丧失观赏价值；此外，成虫将卵产在植物组织中或果实表面影响果实的品质(RobbandParrella,1989;Cockfieldetal.,2007)；二是传播植物病毒，如菊花茎坏死病毒(chrysanthemumstemnecrosisvirus,CSNV)(Bezzaraetal.,1999)、花生环斑病毒(groundnutringspotvirus,GRSV)(Wijkampetal.,1995)、凤仙斑点坏死病毒(impatiensnecroticspotvirus,INSV)(DeAngelisetal.,1993;WijkampandPeters,1993)、烟草条纹病毒(tomatochloroticspotvirus,TCSV)(Wijkampetal.,1995)和番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus,TSWV)(Gardeneretal.,1935)等，使病毒病大流行，造成植物严重减产甚至绝收(Jones,2005)。西花蓟马体型微小，成虫体长1.0~1.5mm，并且与其他蓟马种类形态十分相似。而以往常用的形态学特征识别法只能用于成虫的鉴定，对蛹、幼虫和卵则无能为力，对于不完整的蓟马标本，根本无法根据形态学特征进行鉴别，因此寻找快速准确的西花蓟马鉴定技术是有效阻断其进一步扩散蔓延的必要前提。近年来分子生物学技术发展迅速，利用分子标记技术只需要少量的DNA就可以快速准确地的鉴定出蓟马种类，该类技术不仅可以检测成虫，对成虫前的各个虫态亦具有同样的检测效能，目前已应用于西花蓟马的鉴定研究(Moritzetal.,2000;Brunneretal.,2002;TodaandKomazaki,2002;游中华等,2007;周力兵等,2007)。特征序列扩增区域(sequencecharacterizedamplifiedregions,SCAR)标记技术是通过随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术筛选出靶标种特异片段，然后将目标RAPD片段进行克隆和测序，并根据此目标片段两端的碱基序列设计特异性引物；然后以该对特异性引物对基因组DNA片段再次进行PCR扩增，进而将与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来；SCAR标记为共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示(黎裕等,1999)。与通常采用的限制片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、碱基序列测定等方法相比，SCAR标记技术免去了筛选限制性内切酶和碱基序列测定的过程，不仅结果稳定、灵敏度高、重复性能好，而且操作简便、成本低，特异性引物一旦获得，即可用于大规模检测分析。本研究围绕西花蓟马易随蔬菜、花卉及苗木等的调运而传播蔓延，对农业生产造成 严重威胁，却难以进行快速准确鉴定的科学问题，采用SCAR标记技术，从检测和监测的角度，研究其快速分子检测技术，并以与西花蓟马同域发生的花蓟马、禾花蓟马等其他蓟马种类为对象进行SCAR标记的种特异性检验，以梯度稀释的单头成虫DNA和不同虫态的DNA为模板进行灵敏性检验，并同时对西花蓟马发生地的寄主植物组织进行了检测分析。该研究结果为西花蓟马快速检测体系的构建提供了依据，为有效阻截西花蓟马在我国的进一步扩散蔓延和危害提供了技术保障。1材料与方法1.1供试虫源西花蓟马种群以市售扁豆饲养于中国农业科学院植物保护研究所南区养虫室，国内发生的其他种类的蓟马均采自田间，具体采集信息如表1所示。其中，西花蓟马由蓟马系统分类学专家LAMound教授(CSIROEntomology,Australia)鉴定确认；其他种类的蓟马由闵亮同学经过蓟马形态学鉴定技能培训(主讲专家：华南农业大学资源环境学院张维球教授和童晓立教授)后依据相关资料(韩运发,1997;张维球等,1999;Moritzetal.,2004)鉴定确认。表1用于SCAR引物种特异性检验的蓟马种类Table1ThripsspeciesusedforspeciesspecifictestofSCARprimer编号No.种类Species寄主Hostplant采集地点Collectionlocality采集时间Collectingdate蓟马科Thripidae2花蓟马Frankliniellaintonsa(Trybom)月季Chineserose北京昌平Changping,Beijing2008.103禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)豌豆花Pea甘肃酒泉Jiuquan,Gansu2008.084八节黄蓟马Thripsflavidulus(Bagnall)月季Chineserose北京昌平Changping,Beijing2008.105黄胸蓟马T.hawaiiensis(Morgan)非洲菊Gerbera北京海淀Haidian,Beijing2008.086烟蓟马（葱蓟马）T.tabaciLindeman万寿菊Marigold北京海淀Haidian,Beijing2008.097色蓟马T.coloratusSchmutz杂草HC-3wWeedHC-3新疆伊犁Yili,Xinjiang2008.07.8葱韭蓟马T.alliorum(Priesner)葱Scallion北京密云Miyun,Beijing2008.069黄蓟马T.flavusSchrank苦瓜Bittergourd广西南宁Nanning,Guangxi2008.0510杜鹃蓟马T.andrewsi(Bagnall)茶花Camellia湖南长沙Changsha,Hunan2008.0311棕榈蓟马T.palmiKarny芒果Mmango广西南宁Nanning,Guangxi2008.0512普通蓟马T.vulgatissimusHaliday小叶女贞Ligustrumquihoui福建福州Fuzhou,Fujian2007.1213喜马拉雅蓟马T.himalayanus(Pelikan)杂草wWeed西藏扎囊县Zhanang,Tibet2008.0714带蓟马属Taeniothripssp.AmyotetServille蜘蛛兰Spiderorchid广东广州Guangzhou,Guangdong2007.0715菊花蓟马Microcephalothripsabdominalis(Crawford)非洲菊Gerbera北京海淀Haidian,Beijing2008.0818塔六点蓟马ScolothripstakahashiiPriesner桃树Peach北京海淀Haidian,Beijing2007.1019普通大蓟马Megalurothripsusitatus(Bagnall)丝瓜Loofah湖南长沙Changsha,Hunan2008.0920丝大蓟马Meg.sjostadtiTrybom空心菜Waterspinach湖北武汉Wuhan,Hubei2008.1021端大蓟马Meg.distalis(Karny)葱Scallion湖南长沙Changsha,Hunan2008.0322苏丹呆蓟马AnaphothripssudunensisTrybom葱Scallion福建福州Fuzhou,Fujian2007.1223芒缺翅蓟马AptinothripsstyliferTrybom杂草YL-1wWeedYL-1新疆伊犁Yili,Xinjiang2008.0724茶黄硬蓟马ScirtothripsdorsalisHood女贞Wigustrum北京海淀Haidian,Beijing2008.0525袖指蓟马Chirothripsmanicatus(Haliday)铁菠萝花Ironpineappleflower湖北武汉Wuhan,Hubei2008.1026齿裂绢蓟马Hydatothripsdentatus(SteinwedenetMoulton)大豆Soybean湖北荆州Jingzhou,Hubei2008.0527伪棍蓟马属Pseudodendrothripssp.Schmutz灰绿藻Graygreenalgae河北承德Chengde,Hebei2008.07 28阳针蓟马属Heliothripssp.Haliday甘薯Sweetpotato湖南长沙Changsha,Hunan2008.0929红带滑胸针蓟马Selenothripsrubrocinctus(Giard)红槭木Redmaple湖南长沙Changsha,Hunan2008.09纹蓟马科Aeolothripidae30横纹蓟马Aeolothripsfasciatus(Linnaeus)玉米Corn北京密云Miyun,Beijing2008.0731新疆纹蓟马Aeo.xinjiangensisHan三叶草Clover新疆乌鲁木齐Urumqi,Xinjiang2008.0734间纹蓟马Aeo.intermediusBagnall茼蒿菊ShrubbyArgyranthemum甘肃酒泉Jiuquan,Gansu2008.0835西藏纹蓟马Aeo.xizangensisHan杂草Wweeds西藏扎囊县Zhanang,Tibet2008.0736白腰纹蓟马Aeo.albicinctusHaliday小白菊花Chrysanthemum甘肃酒泉Jiuquan,Gansu2008.0837基白黑蓟马MelanthripspallidiorPriesner蚕豆Horsebean重庆北碚Beibei,Chongqing2008.03管蓟马科Phlaeothripidae38稻简管蓟马Haplothripsaculeatus(Fabricius)芥蓝Cabbagemustard北京顺义Shunyi,Beijing2008.0739华简管蓟马H.chinensisPriesner长鬃蓼Koreanpersicary湖北武汉Wuhan,Hubei2008.1040含羞简管蓟马H.leucanthemi(Schrank)长鬃蓼Koreanpersicary湖北武汉Wuhan,Hubei2008.1041菊简管蓟马H.gowdeyi(Franklin)菊花Chrysanthemum甘肃酒泉Jiuquan,Gansu2008.0942简管蓟马属Haplothripssp.AmyotetServille玉米Corn北京密云Miyun,Beijing2008.0743榕母管蓟马Gynaikothripsficorum(Marchal)榕树Banyan广西南宁Nanning,Guangxi2007.1044榕端宽管蓟马MesothripsjordaniZimmermann榕树Banyan福建福州Fuzhou,Fujian2007.0545棒管蓟马属Bactrothripssp.Karny油菜Rape甘肃酒泉Jiuquan,Gansu2008.0946眼管蓟马属Ophthalmothripssp.Hood黄槐花Yellownecklacepod重庆云阳Yunyang,Chongqing2008.06 1.2基因组DNA的提取蓟马类昆虫基因组DNA的提取参照周志湘等(2007)的方法并稍加改进。将单头西花蓟马/其他种类蓟马置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,1%SDS,20mmol/LNaCl,pH8.0)的parafilm膜上,以PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2次冲洗匀浆器、合并混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60°C℃水浴1h(中途混匀1次)；加入220μL氯仿/异戊醇(V:V=24:1)，轻柔混匀后，冰浴30min；然后4°C℃12000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷无水乙醇，轻柔混匀后于--30°C℃放置30min；4°C℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷75%乙醇洗涤，4°C℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min。每管加入20μL超纯水，充分溶解后于--30°C℃保存备用。1.3RAPD扩增与检测根据本实验室以往的经验和电泳谱带的多态性程度，选取适宜的随机引物6条：H9、，F12、，H16(DeBarroandDriver,1997)、，C08(Callejasetal.,2005)、，OPD08、，OPD03(Patraetal.,2008)。然后分别采用上述6条随机引物(上海生工生物工程技术有限公司协助合成)，以西花蓟马以及其他9种(即花蓟马F.intonsa、禾花蓟马F.tenuicornis、烟蓟马T.tabaci、葱韭蓟马T.alliorum、黄胸蓟马T.hawaiiensis、八节黄蓟马T.flavidulus、豆大蓟马Megalurothripsusitatus、茶黄硬蓟马Scirtothripsdorsalis和稻简管蓟马Haplothripsaculeatus)田间常见蓟马种类的DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为20μL，其中超纯水13.4μL、10×buffer2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、随机引物(20ng/μL)2.0μL、模板DNA2.0μL。扩增程序为：94°C℃预变性5min；45个循环：94°C℃1min、36°C℃1min、72°C℃6min；最后72°C℃延伸6min。扩增反应在ABI-9700PCR基因扩增仪上运行。取6μLPCR扩增产物在1.5%(重量)琼脂糖(Amresco)凝胶上以80V电泳分离50min，然后以GelDocUniversalHoodII型凝胶成像系统(Bio-RadLaboratories)分析电泳结果。1.4特征序列扩增区域(SCAR)标记分析将RAPD-PCR扩增产物中西花蓟马特有的片段进行切胶回收DNA(Omega)，连接、转化、克隆、测序，根据测序结果设计西花蓟马特征片段扩增引物1对；然后，根据所扩增的目的片段检验SCAR引物的特异性。PCR反应体系为20μL，其中超纯水11.4μL、10×buffer2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA2.0μL。扩增程序为：94°C℃预变性2min；35个循环：94°C℃25s、，56°C℃25s、，72°C℃45s；最后72°C℃延伸5min。扩增产物的检测方法同1.3。1.5西花蓟马SCAR引物的种特异性及灵敏性检验分别以田间采集的分属3科21属的41种蓟马(表1)的DNA为模板，以西花蓟马为阳性对照，检验西花蓟马SCAR引物FOMF/FOMR的种特异性。同时，以不同性别及虫态(雌性成虫和雄性成虫；单粒卵，单头一1龄幼虫、二2龄幼虫、预蛹、蛹)的西花蓟马DNA以及梯度稀释(1/10、，1/20、，1/40、，1/80、，1/160、，1/320、，1/640、，1/1280、，1/2560、，1/5120头成虫）的单头雌性成虫DNA为模板，进行灵敏性检验，每虫态、每梯度分别测定10头。1.6西花蓟马发生地的寄主植物检测西花蓟马发生地的寄主植物采集于北京世界花卉大观园，种类有满天星、石竹、四季海棠、蜘蛛兰、冬瓜、黄瓜等。其中冬瓜的检测部位为叶片，其余均为处于开花盛期的鲜花花瓣。称取上述西花蓟马发生地寄主植物的叶片或花瓣各0.5g，以40μL提取缓冲液 1.2基因组DNA的提取蓟马类昆虫基因组DNA的提取参照周志湘等(2007)的方法并稍加改进。将单头西花蓟马/其他种类蓟马置于滴有20μL提取缓冲液(50mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,1%SDS,20mmol/LNaCl,pH8.0)的parafilm膜上,以PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2次冲洗匀浆器、合并混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60°C℃水浴1h(中途混匀1次)；加入220μL氯仿/异戊醇(V:V=24:1)，轻柔混匀后，冰浴30min；然后4°C℃12000r/min离心10min，取上清液，加入440μL预冷无水乙醇，轻柔混匀后于--30°C℃放置30min；4°C℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷75%乙醇洗涤，4°C℃12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min。每管加入20μL超纯水，充分溶解后于--30°C℃保存备用。1.3RAPD扩增与检测根据本实验室以往的经验和电泳谱带的多态性程度，选取适宜的随机引物6条：H9、，F12、，H16(DeBarroandDriver,1997)、，C08(Callejasetal.,2005)、，OPD08、，OPD03(Patraetal.,2008)。然后分别采用上述6条随机引物(上海生工生物工程技术有限公司协助合成)，以西花蓟马以及其他9种(即花蓟马F.intonsa、禾花蓟马F.tenuicornis、烟蓟马T.tabaci、葱韭蓟马T.alliorum、黄胸蓟马T.hawaiiensis、八节黄蓟马T.flavidulus、豆大蓟马Megalurothripsusitatus、茶黄硬蓟马Scirtothripsdorsalis和稻简管蓟马Haplothripsaculeatus)田间常见蓟马种类的DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为20μL，其中超纯水13.4μL、10×buffer2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、随机引物(20ng/μL)2.0μL、模板DNA2.0μL。扩增程序为：94°C℃预变性5min；45个循环：94°C℃1min、36°C℃1min、72°C℃6min；最后72°C℃延伸6min。扩增反应在ABI-9700PCR基因扩增仪上运行。取6μLPCR扩增产物在1.5%(重量)琼脂糖(Amresco)凝胶上以80V电泳分离50min，然后以GelDocUniversalHoodII型凝胶成像系统(Bio-RadLaboratories)分析电泳结果。1.4特征序列扩增区域(SCAR)标记分析将RAPD-PCR扩增产物中西花蓟马特有的片段进行切胶回收DNA(Omega)，连接、转化、克隆、测序，根据测序结果设计西花蓟马特征片段扩增引物1对；然后，根据所扩增的目的片段检验SCAR引物的特异性。PCR反应体系为20μL，其中超纯水11.4μL、10×buffer2.0μL、dNTP(10mmol/L)0.4μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL、上游引物和下游引物(20ng/μL)各2.0μL、模板DNA2.0μL。扩增程序为：94°C℃预变性2min；35个循环：94°C℃25s、，56°C℃25s、，72°C℃45s；最后72°C℃延伸5min。扩增产物的检测方法同1.3。1.5西花蓟马SCAR引物的种特异性及灵敏性检验分别以田间采集的分属3科21属的41种蓟马(表1)的DNA为模板，以西花蓟马为阳性对照，检验西花蓟马SCAR引物FOMF/FOMR的种特异性。同时，以不同性别及虫态(雌性成虫和雄性成虫；单粒卵，单头一1龄幼虫、二2龄幼虫、预蛹、蛹)的西花蓟马DNA以及梯度稀释(1/10、，1/20、，1/40、，1/80、，1/160、，1/320、，1/640、，1/1280、，1/2560、，1/5120头成虫）的单头雌性成虫DNA为模板，进行灵敏性检验，每虫态、每梯度分别测定10头。1.6西花蓟马发生地的寄主植物检测西花蓟马发生地的寄主植物采集于北京世界花卉大观园，种类有满天星、石竹、四季海棠、蜘蛛兰、冬瓜、黄瓜等。其中冬瓜的检测部位为叶片，其余均为处于开花盛期的鲜花花瓣。称取上述西花蓟马发生地寄主植物的叶片或花瓣各0.5g，以40μL提取缓冲液 进行匀浆，其他步骤同1.2；PCR扩增和检测方法同1.4。2结果与分析2.1PCR随机扩增及SCAR标记分析以西花蓟马以及田间常见的其他9种蓟马的DNA为模板，以6条随机引物分别进行扩图1随机引物OPD08对西花蓟马及9种田间常见蓟马扩增结果电泳检测图Fig.1RAPDprofilesofFrankliniellaoccidentalisandotherninefamiliarthripsspeciesusingrandomprimerOPD08M:DNA分子量标准DNAladdermarker;1:西花蓟马F.occidentalis(Pergande);2:花蓟马F.intonsa(Trybom);3:禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel);4:烟蓟马ThripstabaciLindeman;5:葱韭蓟马T.alliorum(Priesner);6:黄胸蓟马T.hawaiiensis(Morgan);7:八节黄蓟马T.flavidulus(Bagnall);8:豆大蓟马Megalurothripsusitatus(Bagnall);9:茶黄硬蓟马ScirtothripsdorsalisHood;10:稻简管蓟马Haplothripsaculeatus(Fabricius).箭头所示为西花蓟马的特异性条带.Thearrowindicatesthespecificfragmentofthewesternflowerthrips.M12345678910bp20001000750500250100增。电泳检测结果显示，随机引物OPD08(GTGTGCCCCA)的特异性较强、电泳谱带多态性高(图1)，能扩增出一条西花蓟马特有的条带(图1中箭头所示)。将该特异条带切胶、回收纯化，并对纯化产物进行电泳检测。然后将回收产物与pGEM-TEasy载体连接，连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞[(天根生化科技(北京)有限公司])；通过蓝白斑筛选，挑取白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定；然后将分子量大小与预期一致的阳性菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序。测序结果表明该片段长569bp，GenBank登录号为GU045557，为基因组DNA中的随机克隆片段。根据测序结果设计SCAR引物1对：FOMF/FOMR，上游引物碱基序列为：5′-GAAACTACTATTGTTTGTGAGCTG-3′，下游引物碱基序列为：5′-AAGAAACTAACGTGAAGGATACTC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司协助合成，其扩增片段大小为320bp。2.2西花蓟马SCAR引物的种特异性及灵敏性检验以西花蓟马及田间采集的其他41种蓟马的DNA为模板，以所设计的特异性引物FOMF/FOMR进行PCR扩增，电泳检测结果显示(图2)，该引物只对西花蓟马具有扩增效果，对其他种类的蓟马不具有扩增能力，表明该引物为西花蓟马的特异性引物。 图2SCAR引物FOMF/FOMR种特异性检验Fig.2AmplificationpatternofgenomicDNAusingSCARprimersFOMF/FOMRM:DNA分子量标准DNAladdermarker;泳道1,16,17,32,33,47:西花蓟马Frankliniellaoccidentalis;2--15,18--31,34--46:其他种类蓟马，编号顺序与表1同Otherthripsspecies,numberedinthesameorderasintheTable1.2000100075050025010020001000750500250100M10987654321bpM111213141516bp2000100075050025010020001000750500250100M474645444342bpM414039383736353433bp2000100075050025010020001000750500250100M282930313217bpM27262524232221201918bp以不同性别和不同虫态的西花蓟马DNA为模板，以SCAR引物FOMF/FOMR进行PCR扩增，检测结果显示，不同性别、不同虫态的西花蓟马(图3：A)均能稳定地扩增出320bp的特异性片段。当将单头雌性成虫的DNA模板进行梯度稀释至1/160头时，所有个体均可扩增出特异性的靶标片段；当稀释为1/320头成虫时，80%的个体条带清晰；当稀释为1/1280头成虫时，尚有20%的个体可以扩增出微弱的靶标片段(图3：B)。表明，该对引物灵敏性较高，其最低检出阈值为1/160头成虫。图3SCAR引物FOMF/FOMR对西花蓟马DNA模板灵敏性检测电泳图Fig.3AmplificationpatternofFrankliniellaoccidentalisDNAusingSCARprimersFOMF/FOMR.A:不同虫态和性别Differentdevelopmentalstagesandsexes.M:DNA分子量标准DNAladdermarker;1:单粒卵Oneegg;2:1龄幼虫First1stinstarlarva;3:2龄幼虫Second2ndinstarlarva;4:预蛹Pre-pupa;5:蛹Pupa;6:雌性成虫Femaleadult;7:雄性成虫Maleadult.B:不同模板稀释倍数Differentdilutions.M:DNA分子量标准DNAladdermaker;1--10：分别为1∕10、，1∕20、，1∕40、，1∕80、，1∕160、，1∕320﹑，1∕640、，1/1280、，1/2560、和1/5120头雌性成虫DNA.Lanes1-10weredDilutions1∕10,1∕20,1∕40,1∕80,1∕160,1∕3201∕640,1/1280,1/2560and1/5120DNAofawholefemaleadultofF.occidentalis,respectively.M123456720001000750500250100AM1234567891020001000750500250100B2.3西花蓟马发生地寄主植物组织的检测以西花蓟马发生地的寄主植物组织DNA为模板，以SCAR引物FOMF/FOMR进行PCRM1234567bp20001000750500250100图4SCAR引物FOMF/FOMR对西花蓟马发生地寄主植物组织检测电泳图Fig.4AmplificationpatternofhostplanttissuescollectedfromFrankliniellaoccidentalisinfestedfieldsusingSCARprimersFOMF/FOMR.M:DNA分子量标准DNAladdermarker;泳道1--6为：采自西花蓟马发生区的植物组织Lanes1-6arepPlanttissuescollectedfromF.occidentalisinfestedfields;.1:满天星花瓣Flowersofbaby'sbreath,;2:冬瓜叶片Leavesofwaxgourd,;3:石竹花瓣Flowersofdianthus,4:四季海棠花瓣Flowersofbeddingbegonia,;5:蜘蛛兰花瓣Flowersofspiderorchid,;6:黄瓜花瓣Flowersofcucumber;泳道7:西花蓟马未发生区的黄瓜花瓣CucumberflowerscollectedfromF.occidentalisun-infestedfieldsasthenegativecontrol. 扩增，检测结果表明，在冬瓜的叶片以及满天星、石竹、四季海棠、蜘蛛兰和黄瓜的花瓣中均扩增出了靶标片段，且条带清晰(图4)，表明该技术体系对带有虫卵的寄主植物组织亦具有同样的检测效果。3讨论西花蓟马寄主范围广泛，以锉吸式口器直接取食为害，不仅使园林花卉植物失去观赏价值，严重影响果树、蔬菜的产量和质量，还可传播多种植物病毒，使病毒病大发生，增加生产成本，造成严重减产，甚至绝收。西花蓟马体型微小，雄性成虫体长1.0mm左右，雌性成虫体长1.3~1.5mm，而且与其他常见的蓟马种类如花蓟马、禾花蓟马、烟蓟马等形态相似；并且，成虫常将卵产在寄主植物组织中，而预蛹期和蛹期主要在土壤中度过。鉴于目前西花蓟马仅在我国局部地区发生危害(张友军等,2003;徐家菊和韦丽莉,2005;郑长英等,2007)，并且具有进一步扩散蔓延的趋势，因此西花蓟马的快速准确鉴定是有效阻止其进一步扩张、保障农业生产安全和生态安全的必要前提，而以往传统的比较形态学鉴定方法对于广大非蓟马分类学人员而言难以满足快速鉴定和有效阻断的需求。本研究采用的SCAR分子标记技术特异性强，可以将西花蓟马与我国常见的41种其他种类的蓟马区分开。此外，该技术灵敏度高，不仅可以检测西花蓟马的单头成虫、幼虫、预蛹及蛹，还可检测单粒卵；当以梯度稀释的单头雌性成虫的DNA为模板进行PCR扩增时，其最低检出阈值为1/160头。而更为有价值的是，该技术还可以快速准确地检测西花蓟马发生地的寄主植物是否带有卵，表明，该SCAR标记技术完全可以用于口岸及蔬菜、花卉、种苗调运中西花蓟马的检测及其扩散趋势监测。近年来，已有多种分子标记技术用于蓟马种类鉴定。如Moritz(2000)采用转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)-限制片段长度多态性(ITS-RFLP)的方法，先行扩增出西花蓟马和美棘蓟马EchinothripsamericanusMorgan的ITS-1和ITS-2片段，然后选用5种内切酶消化两种蓟马的ITS片段，以产生不同的带型；此方法可以成功地将两种蓟马区分开，但是无法将西花蓟马与其他种类的蓟马区分开。Brunner等(2002)根据线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基ⅠI(mitochondriacytochromeoxidasesubunitI,mtDNACOI)433bp的扩增产物，结合测序和扩增产物RFLP分析，构建系统发育树，有效区分了西花蓟马、烟蓟马和棕榈蓟马等。Todaand和Komazaki(2002)采用ITS-2-RFLP法鉴别日本果树上常见的9种蓟马的成虫和幼虫，此法将PCR和RFLP相结合，比形态学鉴定更加快速、准确，而且结果可靠；但是酶切条件要求严格，并且很难找到合适的酶将西花蓟马与其他大部分种类的蓟马区分开。周力兵等(2007)利用Bruner等(2002)设计的简并引物mtD-7.2F和mtD-9.2R扩增出了6种蓟马的mtDNACOI基因片段(450bp)，然后针对西花蓟马片段设计了特异性引物F.OL1/F.OR和F.OL2/F.OR，该两对引物可以将西花蓟马的成虫、幼虫、蛹与其他5种蓟马区分开；同时，此法避免了对PCR产物进行RFLP的过程，且结果可靠，明确易读；然而，实际检测中所涉及的蓟马种类较多，因此引物的特异性尚待进一步验证。游中华等(2007)采用PCR产物直接测序法对包括西花蓟马在内的9种蓟马的COI基因片段(433bp)进行序列分析，可以准确地检测各虫态的西花蓟马；但是，由于需要对扩增产物进行测序，成本较高且费时，因此难以满足高通量快速检测的需求。本研究中采用SCAR标记技术获得了对西花蓟马具有特异扩增效果的引物1对，该对引物不仅特异性强、灵敏度高，而且还可以明确来源于疫区但不具有被害症状的寄主植物组织中是否携带西花蓟马的卵。此外，SCAR检测技术操作方便快捷，结果可靠且稳定性好、重现性高，可以快速检测大量个体。SCAR分析谱带单一，最适宜应用于定性检测，该技术体系的建立，对口岸检疫以及蔬菜、花卉及其种苗调运中的检疫、检测与监测，有效阻止西花蓟马的进一步传播扩散，明确其传播扩散机制具有重要意义；同时，该技术体系还可用于筛选评价本地捕食性天敌对西花蓟马控制作用研究。 参考文献（References）BaileySF,1940.ThedistributionofinjuriousthripsintheUnitedStates.JournalofEconomicEntomology,33:133-136.BezzaraIC,DeResendeRO,PozzerL,NagataT,KormelinkR,DeAvilaAC,1999.IncreaseoftospoviraldiversityinBrazilwiththeidentificationoftwonewtospovirusspecies,onefromchrysanthemumandonefromzucchini.Phytopathology,89(9):823-830.BrunnerPC,FlemingC,FreyJE,2002.Amolecularidentificationkeyforeconomicallyimportantthripsspecies(Thysanoptera:Thripidae)usingdirectsequencingandaPCR-RFLP-basedapproach.AgriculturalandForestEntomology,4(2):127-136.CallejasC,VelascoA,GobbiA,BeitiaF,OchandoMD,2005.Fastdiscrimination(RAPD-PCR)ofthespeciesformingthepestcomplexAleurodicusdispersus–Lecanoideusfloccissimus(Hom:Aleyrodidae).JournalofAppliedEntomology,129(7):382-385.ChengJF,WanFH,GuoJY,2006.AnalysisofpotentialdistributionoftheinvadedinsectFrankliniellaoccidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)inChina.ActaEntomologicaSinica,49(3):438-446.[程俊峰,万方浩,郭建英,2006.入侵昆虫西花蓟马的潜在适生区分析.昆虫学报,49(3):438-446]CockfieldSD,BeersEH,ZackRS,2007.PhenologyofwesternflowerthripsFrankliniellaoccidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)onplantspeciesinandnearappleorchardsinWashingtonState.JournaloftheEntomologicalSocietyofBritishColumbia,104(11):35-44.DeAngelisJD,SetherDM,RossignolPA,1993.Survival,developmentandreproductioninwesternflowerthrips(Thysanptera:Thripidae)exposedtoimpatiensnecroticspotvirus.EnvironmentalEntomology,22(6):1308-1312.DeBarroPJ,DriverF,1997.UseofRAPDPCRtodistinguishtheBbiotypefromotherbiotypesofBemisiatabaci(Gennadius)(Hemiptera:Aleyrodidae).AustralianJournalofEntomology,36:149-152.GardenerMC,TompkinsCM,WhippleOC,1935.Spottedwiltoftruckcropsandornamentalplants.Phytopathology,25:17.HanYF,1997.EconomicInsectFaunaofChina,FASCVol.55,.Thysanoptera.SciencePress,Beijing.513pp,220figures.[韩运发,1997.中国经济昆虫志,第五十五册,缨翅目.北京:科学出版社.513页,220幅图]JiangXL,BaiS,XiaoS,YangB,2001.ServicefortheinternationalflowerfestivalinKunming,China.PlantQuarantine,15(2):115-117.[蒋小龙,白松,肖枢,杨碧,2001.为中国昆明国际花卉节把关服务.植物检疫,15(2):115-117]JonesDR,2005.Plantvirusestransmittedbythrips.EuropeanJournalofPlantPathology,113:119-157.KirkWDJ,TerryLI,2003.ThespreadofthewesternflowerthripsFrankliniellaoccidentalis(Pergande).AgriculturalandForestEntomology,5:301-310.LiY,JiaJZ,WangTY,1999.Typesofmolecularmarkersandtheirdevelopment.BiotechnologyInformation,(4):19-22.[黎裕,贾继增,王天宇,1999.分子标记的种类及其发展.生物技术通报,(4):19-22]MoritzG,2002.Thebiologyofthripsisnotthebiologyoftheiradults:adevelopmentalview.In:MarulloR,MoundLAeds.ThripsandTospoviruses.Proceedingsofthe7thInternationalSymposiumonThysanoptera,RegioCalabriaItaly.259-267.MoritzG,DelkerC,PaulsenM,MoundLA,BurgermeisterW,2000.ModernmethodsforidentificationofThysanoptera.EPPOBulletin,30:591-593.MoritzG,MoundLA,MorrisDC,GoldarazenaA,2004.PestThripsoftheWorld:anIdentificationandInformationSystemUsingMolecularandMicroscopicalMethods.CD-ROM.Brisbane:CenterforBiologicalInformationTechnology,UniversityofQueensland.Brisbane,Australia.PatraB,AcharyaL,MukherjeeAK,PandaMK,PandaPC,2008.MolecularcharacterizationoftencultivarsofCannalilies(CannaLinn.)usingPCRbasedmolecularmarkers(RAPDsandISSRs).InternationalJournalofIntegrativeBiology,2(2):129-137.RobbLK,ParrellaPM,1989.Westernflowerthrips,aseriouspestoffloriculturalcrops.In:ParkerLB,SkinnerM,LewisTeds.TowardsUnderstandingThysanoptera.ProceedingsofInternationalConferenceonThrips.February21-23,1989.Burlington,Vermont.343-358.TodaS,KomazakiS,2002.Identificationofthripsspecies(Thysanoptera:Thripidae)onJapanesefruittreesbypolymerasechainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphismoftheribosomalITS2region.BulletinofEntomologicalResearch,92:359-363.WijkampI,AlmarzaN,GoldbachR,PetersD,1995.Distinctlevelsofspecificityinthripstransmissionoftospoviruses.Phytopathology,85(10):1069-1074.WijkampI,PetersD,1993.DeterminationofthemedianlatentperiodoftwotospovirusesinFrankliniellaoccidentalis,usinganovelleafdiskassay.Phytopathology,83(9):986-991.XuJJ,WeiLL,2005.Invadedinsectpest—FrankliniellaoccidentalisfirstreportedinthecityofLincang.PlantQuarantine,19(5): 294-295.[徐家菊,韦丽莉,2005.临沧市新发现外来有害生物——西花蓟马.植物检疫,19(5):294-295]YouZH,LuH,ZhangXS,FengJN,ShiBC,GongYJ,HuangDW,2007.Molecularidentificationoftheintroducedwesternflowerthrips,Frankliniellaoccidentalis(Pergande)andothereightcommonthripsspecies(Thysanoptera:Thripidae).ActaEntomologicaSinica,50(7):720-726.[游中华,路虹,张宪省,冯纪年,石宝才,宫亚军,黄大卫,2007.入侵害虫西花蓟马及其他8种常见蓟马的分子鉴定.昆虫学报,50(7):720-726]YudinLS,ChoJJ,MitcheuWC,1986.Hostrangeofwesternflowerthrips,Frankliniellaoccidentalis(Thysanoptera:Thripidae),withspecialreferencetoLeucaenaglauca.EnvironmentEntomology,15(6):1292-1295.ZhangWQ,TongXL,LuoXN,ZhuoWX,1999.Thysanoptera.In:HuangBKed.FaunaofInsectsinFujianProvinceofChina.Vol.1.FujianScienceandTechnologyPublishingHouse,Fuzhou.348-395.[张维球,童晓立,罗肖南,卓文禧,1999.缨翅目Thysanoptera.见:黄邦侃主编.福建昆虫志(第一卷).福州:福建科学技术出版社.348-395]ZhangYJ,WuQJ,XuBY,ZhuGR,2003.Dangerousalieninvasivespecies,westernflowerthripsmakedamagesinBeijing.PlantProtection,29(4):58-59.[张友军,吴青君,徐宝云,朱国仁,2003.危险性外来入侵生物——西花蓟马在北京发生危害.植物保护,29(4):58-59]ZhengCY,LiuYH,ZhangNQ,ZhaoXL,2007.Invadedinsectpest—FrankliniellaoccidentalisfirstreportedinShandongProvince.JournalofQingdaoAgriculturalUniversity(NaturalScience),24(3):172-174.[郑长英,刘云虹,张乃芹,赵希丽,2007.山东省发现外来入侵有害生物——西花蓟马.青岛农业大学学报(自然科学版),24(3):172-174]ZhouLB,LiuZS,LiCY,DingYM,2007.MethodofthepolymerasechainreactionforidentificationofFrankliniellaoccidentalis.PlantQuarantine,21(2):78-81.[周力兵,刘忠善,李春艳,丁元明,2007.PCR法鉴定西花蓟马.植物检疫,21(2):78-81]ZhouZX,WanFH,ZhangGF,ChenB,2007.ArapidmethodforextractionofgenomicDNAofBemisiatabaci.PlantProtection,33(5):131-133.[周志湘,万方浩,张桂芬,陈斌,2007.烟粉虱基因组DNA快速提取方法.植物保护,33(5):131-133]（责任编辑：袁德成）