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1、人CyclinE原核表达载体的构建及表达李珊,潘全,李云龙,叶昕【关键词】Cyclin,E;,基因克隆;,原核表达 [摘要]目的:构建人CyclinE基因原核表达载体,并在E.coliBL21中表达并纯化。方法:PCR扩增人CyclinE基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)CyclinE。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长约为1200bp的人的CyclinE基因片段。以构建的重组质粒
2、pET32a(+)CyclinE转化E.coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDSPAGE、期,有G1/S限制点和G2/M两个限制点。在哺乳动物细胞周期的运行中,有许多酶参与,其中最核心的酶是由一组作为催化亚基的周期蛋白依赖激酶(CDK)和一组作为调节亚基的周期蛋白(Cyclins)组成的异二聚复合体[1],两者结合后形成细胞周期调节复合物(cyclinCDK)并具有激酶活性,能磷酸化细胞周期中相应的细胞因子以推进细胞周期的进行。在细胞周期蛋白中,CyclinE属于G1期细胞周期
3、的正调节因子,参与G1/S转换点功能的调控,与其他参与G1/S转换点功能调控的因子CyclinDS、抑癌基因视网膜神经胶质细胞瘤蛋白[2](retinoblastomaprotein,Rb)、转录因子E2F、抑癌基因p53、KIP家族、CDK2、4、5等相互作用共同决定细胞的生存和凋亡。而一旦细胞进入S期CyclinE即被泛素化降解。细胞周期调控是当前肿瘤学研究的热点,细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关。为此,我们构建人CyclinE基因的原核表达载体,并在E.coliBL21中表达,为今后发现并研究CyclinE/Cdk2的新底
4、物奠定了基础。 1材料和方法 1.1材料EcoRI,XhoI,T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Tiangen公司。AntiRabbitIgGHRP购自美国Promega公司。IPTG购自Merk公司。DNAladder由北京Tiangen公司提供。pDESTCyclinE载体、pET32a(+)载体、E.coliBL21、及兔源antiCyclinE抗体,由本实验室保存。 1.2方法 1.2.1人CyclinE的PCR扩增根据CyclinE的序列设计特异性引物,将其从pDESTCy
5、clinE载体上克隆。上游引物序列为:acgtgaattcatgaaggaggacggcggcgc;下游引物的序列为:tagcctcgagtcacgccatttccggcccgctg,其中下划线分别为EcoRI与XhoI酶切位点,引物均由北京英骏公司合成。PCR反应条件:95℃5min,95℃1min,50℃45s,72℃1min,循环30次后,72℃延伸5min。 1.2.2原核表达载体pET32a(+)CyclinE的构建用EcoRI、XhoI分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒,经琼脂糖凝胶回收,将载体和目的片段用T
6、4连接酶4℃连接过夜。将连接的重组质粒pET32a(+)CyclinE转化E.coliDH5α,在含有50mg/L氨苄的LB琼脂糖培养基中于37℃培养过夜。挑选阳性克隆,扩增后提取质粒,并用EcoRI与XhoI酶切鉴定。 1.2.3人HisCyclinE融合蛋白的诱导表达将重组质粒pET32a(+)CyclinE转化E.coliBL21,在含50mg/L氨苄的LB培养基中摇菌过夜,后以1∶100转接到新鲜的含50mg/L氨苄的LB培养基。37℃摇菌2.5h后,加入IPTG至终浓度0.6mmol/L,37℃诱导4h,5000r/m
7、in离心10min收菌。菌体用PBS洗涤1次,后加入超声液(20mmol/LNa2HPO4,0.5mol/LNaCl,10mmol/Limidazole,1mmol/LPMSF)重悬,以超声5s,间隔10s,全程时间20min,保护温度8℃超声破菌,12000g离心20min,取上清进行SDSPAGE,分析HisCyclinE的诱导表达情况。 1.2.4人HisCyclinE纯化将HisCyclinE上清加入NiNTABeads中,4℃结合2h,加入5倍柱体积的mol/LNa2HPO4,0.5mol/LNaCl,20mmol/L
8、imidazole,2%TritonX100,pH7.4)在混合器上洗涤10min后,分别用1mL50mmol/L,75mmol/L,100mmol/L,125mmol/L,150mmol/L的ElutionBuffer(20mmol/LNa2HP
