猪传染性胃肠炎病毒全基因组扩增与s蛋白表达

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1、摘要猪传染性胃肠炎(TransmissibleGastroenieritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TransmissibleGastroenteritisVirusofSwine，TGEV)引起一种高度接触性肠道传染病，它的主要症状是呕吐、腹泻和脱水，对我国的养猪业造成了很大的危害。本研究对实验室先前进行的流行病调查所检测到的疑似感染TGEV阳性粪样进行处理后，对TGEV敏感的ST细胞及PK15细胞进行攻毒，盲传10代后ST细胞产生病变，收集第10代的细胞液。同时参照GenBank数据库中收录的TGEV的TS株S基因B、C位点的序列设计一段特异性引物，对已产生病变的细胞液进行RT

2、-PCR检测，经过电泳检测后发现了预期大小的TGEVS基因B、C位点的目的片段，测序后与GenBank数据库中S基因B、C位点序列核苷酸同源性达到99.6%，证明了成功分离并培养了TGEV，命名为TGEV-AYU株。利用GenBank上已公布的TGEV全基因序列设计17对特异性引物，以大量扩增的TGEV细胞液为模板，对AYU株进行RT-PCR扩增，对得到的17个cDNA片段经过克隆后送到生物公司进行测序、拼接，获得一个TGEV基因组全长的cDNA序列，与GenBank中已收录的其余的TGEV分离株序列进行比对后发现AYU株与PurdueP115株的序列同源性高达99.5%。TGEV-AYU株

3、序列全长为28580bp，含有7个开放阅读框，将其提交GenBank收录，收录号为HM776941。TGEV全基因序列测定后可以对下一步即将进行的TGEV的感染性克隆奠定良好的基础。设计一段TGEVS基因D位点缺失序列的特异性引物，利用RT-PCR法扩增出的基因片段，克隆到原核表达载体pET-32a上，经酶切、测序鉴定后，再将重组表达质粒转化至大肠杆菌探查BL21中，用终浓度lmmol∙L-1IPTG诱导，表达产物以包涵体形式存在。超声波裂解菌体后对包涵体进行溶解，再用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化，并对纯化的蛋白进行复性。S蛋白的表达为下一步蛋白功能基因组研究及ELISA检测方法的建立奠

4、定了基础，另外可以为TGEV单克隆抗体的制备提供蛋白。关键词：猪传染性胃肠炎病毒；AYU株；RT-PCR；序列分析；原核表达CloningofGenomeofPorcineTransmissibleGastroenteritisVirusandExpressionofSProteinAbstractTransmissiblegastroenteritisofswine(TGE)isaimportantentericinfectiousdiseasescausedbytransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV).TheclinicalsymptomsofTGE

5、Visdiarrheaanddehydrationandvomiting.Itbecomesthemostimportantdiseasethreatthepigindustry.ThepossiblepositivewerehomogenatedandthesupernatantwasincubatedontheSTandPK15cellmonolayer,thevirusinducedcytopathiceffect(CPE)aftertengenerationspassedonthecells.ApairofprimerswasdesignedbasedonGenBankofSgene

6、B_Cposition.TheexpectedDNAwereamplifedbyRT-PCR,theresultsshowedthatwasSgeneB_Cposition.HomologyoftheSgeneB_Cpositionismorethan99.6%comparedwiththepublishedintheGenBank.ThisTGEVstrainiscalledAYUstrain.SeventeenpairsofprimerscoveringthewholegenomeofTGEVweredevisedaccordingtothepublishedsequencesaswel

7、lasanalysisoftherestrictionribonucleasemap,17cDNAfragmentswereamplifiedbyRT-PCR.Theamplifiedfragmentswerefurtherclonedandsequenced.Thesizeofcompletegenomeis28,580andcomprisesof7ORFs.Comparisonwithotherisola