沙门菌质粒毒力基因spv对dcs自噬、凋亡和免疫调节功能的影响

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1、-------沙门菌质粒毒力基因spv对DCs自噬、凋亡和免疫调节功能的影响中文摘要沙门菌质粒毒力基因spv对DCs自噬、凋亡和免疫调节功能的影响中文提要目的：通过细胞模型和实验动物模型，研究沙门菌毒力基因（Salmonellaplasmidvirulencegenes，spv）对树突状细胞（dendriticcells，DCs）自噬、凋亡和免疫调节功能的影响及其分子机制，探索通过调控细胞自噬和凋亡水平增强机体免疫功能以控制感染进程的新途径，并为后续新药靶位的发现提供理论和实验依据。方法：1.细胞模型

2、的体外实验。以携带spv基因的伤寒沙门菌（Salmonellatyphi，ST）ST8为研究对象，用含spv基因的鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11作为阳性对照、不携带spv基因的伤寒沙门菌ST10作为阴性对照，将细菌与小鼠骨髓来源的DCs（bonemarrow-derivedDCs，BMDCs）共培养；同时用不加细菌的正常细胞作对照组；另设自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干预组，即将细胞预先用含RAPA的培养基过夜处理后分别与上述三种细菌共培养。分别于不同时间段收获细胞，用Wester

3、nblot法检测BMDCs自噬蛋白Beclin-1的表达，比色法测定其Caspase-3的活性，流式细胞术（flowcytometry，FCM）分析BMDCs的凋亡率、吞噬能力以及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，混合淋巴细胞反应（mixedlymphocytereaction，MLR）检测BMDCs刺激CD4+和CD8+初始型T（naiveT）细胞增殖的能力，ELISA法测定培养液上清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等细胞因子的水平，台盼蓝染色法进行活细胞计数，平板菌落

4、计数法检测BMDCs内活菌数。2.小鼠模型的体内实验。由于伤寒沙门菌是一种严格只对人类致病的病原体，没有合适的动物模型和有效的遗传学工具，本实验利用与其有非常近缘关系的鼠伤寒沙门菌建立动物感染模型，用鼠伤寒沙门菌标准毒株SR-11和不携带spv基因的低毒株BRD509经腹腔注射感染小鼠；同时以未感染细菌的小鼠作为正常对照组；I-----------中文摘要沙门菌质粒毒力基因spv对DCs自噬、凋亡和免疫调节功能的影响另设RAPA干预组，即在感染模型建立后每天经腹腔注射适量RAPA。分别在不同时间段观察

5、小鼠一般状态，处死小鼠后比较肝脏和脾脏的病理变化，免疫组化法检测肝脏和脾脏Beclin-1和Caspase-3蛋白的表达，FCM分析脾脏DCs的凋亡率、吞噬能力及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，MLR检测脾脏DCs刺激naiveT细胞增殖的能力，ELISA法测定血清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等细胞因子的水平，平板菌落计数法检测小鼠肝脏和脾脏的活菌数。结果：1.用RAPA干预前，细菌与BMDCs共作用后2h，ST10组的Beclin-1表达量高于SR-11组和ST8

6、组，RAPA干预后0h即可出现此差异；体内实验显示细菌感染早期，BRD509组小鼠脏器的Beclin-1表达高于SR-11组。用RAPA干预后体内外各组Beclin-1的表达均升高。2.用RAPA干预前，体内外各组DCs的凋亡率和Caspase-3活性均随感染时间的延长逐渐升高。体外实验SR-11组和ST8组高于ST10组，用RAPA干预后，SR-11组和ST8组下降，而ST10组上升；体内小鼠脾脏DCs的凋亡率和Caspase-3活性表现为SR-11组高于BRD509组，用药后SR-11组降低，而B

7、RD509组升高。3.用RAPA干预前，随感染时间的延长，体内外实验各组DCs的吞噬能力均不断下降。体外实验ST10组的吞噬率低于SR-11组和ST8组；体内实验BRD509组的吞噬率低于SR-11组。用RAPA干预后，体内外各组DCs的吞噬率均明显下降。4.用RAPA干预前，体内外各组DCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达均随感染时间的延长逐渐升高，刺激naiveT细胞增殖的能力也不断增强。体外实验显示ST10组明显强于SR-11组和ST8组；体内实验BRD509组明显强于SR-11

8、组。用RAPA干预后，体内外各组DCs共刺激分子的表达均上升，naiveT细胞的增殖程度亦升高。5.用RAPA干预前，体内外各组IL-12和IFN-γ水平随着时间延长显著升高。体外表现为ST10组明显高于SR-11组和ST8组；体内实验BRD509组明显高于SR-11组。用RAPA干预后，体内外各组IL-12和IFN-γ的水平均上升。6.用RAPA干预前，体内外各组在细菌感染早期均未检测到IL-10。体外感染II-----------沙门菌质粒毒力基因s