沙门菌质粒和毒力基因对细胞自噬的影响及其分子机制研究

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1、苏州大学博士学位论文沙门菌质粒和毒力基因对细胞自噬的影响及其分子机制研究姓名：吕杰申请学位级别：博士专业：病原生物学指导教师：黄瑞2012-09沙门茵质粒和毒力基因对细胞自噬的影响及其分子机制研究中文摘要目的：通过建立沙门菌感染的细胞模型，观察伤寒沙门菌质粒pRsT98及与其密切相关的沙门菌质粒毒力基因(SalmonellaplasmidvirulencegeneB，spvB)对自噬及感染结局的影响，探讨其发生机制及相关信号通路，以期揭示沙门菌质粒毒力基因增强宿主菌毒力的分子机制，为探索通过调控细胞自噬水平控制沙门菌

2、感染的新途径，并为后续新药靶点的发现及疫苗开发提供实验和理论依据。方法：1．沙门菌质粒对细胞自噬及感染结局的影响。以携带质粒pRsT98的伤寒沙门菌(Salmonellatyphi，S．typhi)野生株ST8为实验株，消除pRsT98的突变株STs-ApRsT98为阴性对照株，携带沙门菌质粒毒力基因(Salmonellaplasmidvirulencegene，spy)的鼠伤寒沙门菌标准毒株(Salmonellatyphimurium)SR一11为阳性对照株，将受试菌与野生型小鼠胚胎成纤维细胞(widetypemo

3、useembryonicfibroblasts，WT-MEFs)及自噬基因5缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞(autophagyassociatedgene5deficientmouseembryonicfibroblasts，At95+MEFs)体外共培养，制作细胞感染模型。以对数生长期细菌按感染复数(multiplicityofinfection，MOI)为100：1感染细胞，同时设立WT--MEFs的自噬激动剂——雷帕霉素(rapamycin，RAPA)干预组。将细胞与细菌共作用1h后吸取上清，此时定为“0”点，加入含

4、有100，,g／ml的阿米卡星(Amikacin，AMK)培养液作用2h以去除胞外菌，然后将AMK浓度降为10yg／rIll以抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长。分别在感染的不同时间段(1h、3h、5h、8h和10h)收获细胞，采用以下方法进行实验检测：①单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)染色，荧光显微镜下观察细胞内点状自噬囊泡；②透射电镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)观察细胞内双层或多层膜结构的自噬小体；③WesternBlotting(W

5、B)检测细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链3-11(Microtubule-associatedprotein1lightchain3-11，MAP1-LC3-1I，即LC3-II)表达情况；④Annexin．V--FITC／PropidiumIodide(Ann．V／PI)双染流式细胞术(flowcytometry，FCM)分析细胞凋亡率；⑤梯度稀释平板菌落计数法检测胞内集落形成单位(colonyformingunit，CFU)。T中文摘要沙门菌质粒和毒力基因对细胞自噬的影响及其分子机制研究2．沙门菌质粒毒力基

6、因spvB影响细胞自噬及机制研究。以spvB缺陷的鼠伤寒沙门菌SR一11突变株(SR一11-AspvB)及含有spvB的野生型鼠伤寒沙门菌标准毒株SR一11(SR一11)为研究对象，将实验菌株体外感染WT-MEFs及At95-／MEFs，MOI为100：1，细胞感染过程同第一部分。分别在感染的不同时间段(1h、3h、5h、8h和10h)收获细胞，进行以下实验：①WB检测细胞LC3-II蛋白、磷脂酶D(phospholipaseD1——PLD1和phospholipaseD2——PLD2)蛋白及ToU样受体4(Toll

7、qikereceptors4，TLR4)蛋白表达情况；②放射性【9，10-3H],灌t酸标记检测感染细胞的PLD活性；③逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)检测细胞TLR4信使RNA(messangerRNA，mRNA)表达情况；④Ann．ⅧI双染FCM分析细胞凋亡率；⑤酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)检测细胞Thl型细胞因子干扰素一y(Interferon-T，IFN吖)

8、及Th2型细胞因子白细胞介素-4(interleukin-4，Ⅱ一)和白细胞介素一13(interleukin一13，IL一13)的表达；⑥梯度稀释平板菌落计数法检测胞内CFU。结果：1．沙门菌质粒对细胞自噬及感染结局的影响(1)MDC荧光染色结果：ST8及SR一11感染的各组细胞中，在感染早期，WT-MEFs内可见很少量的点状自噬囊泡颗粒，R