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1、RP-HPLC法测定蛹虫草人工固体培养物中虫草素的含量汪晓宁1富艳虹1杨光照2王晓晨2汪宇3孙健3李葶婷3(1中国人民解放军93271部队卫生队辽宁沈阳110002)(2沈阳军区总医院辽宁沈阳110016)(3中国人民解放军第463医院药剂科辽宁沈阳110042)【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】1672-50S5(2010)27-0085-02【摘要】目的建立RP-HPLC法测定蛹虫草人工固体培养菌皮中虫草素的含量。方法釆用PH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇(85:15)为流动相,流速为l.Oml/min,检测波长为260nm。结果
2、蛹虫草人工固体培养物-菌皮中主要成分虫草素在4.03~100.8μg/ml范围内线性关系良好，回归方程为A=39.58C-0.0342。结论人工固体培养菌皮中虫草素的含量随培养时间发生一定的变化，RP-HPLC法可用于蛹虫草的人工培养物中虫草素的定量测定，为控制人工培养蛹虫草质量提供了简便易行的方法。【关键词】蛹虫草虫草素RP-HPLC蛹虫草［Cordycepsmilitaris(L.Fr}Link］，别名北冬虫夏草，属真菌门(Eumycota)核菌纲(Pyrenomycetes)虫草属(Cordyceps)。核苷类化合物为蛹虫草及其培养
3、物中的主要活性成分［1］,其中虫草素是一种核苷类抗生素，对多种肿瘤具有抑制作用［2,3］,其在蛹虫草中的含量明显高于冬虫夏草。目前蛹虫草的人工培育可以将从天然蛹虫草中分离、纯化得到的菌种接种在固体培养基上长出子座，因此对虫草及其人工培养物的质量评价需要简便、有效的方法。文献多报道对天然冬虫夏草及其人工培养物中多种成分的含量测定［4-6］,木文首次采用HPLC法测定了蛹虫草人工固体培养物-菌皮中虫草素的含量，并发现该培养物中虫草素含量高于文献报道其在子座中的含量［7］。1材料Waters510型高效液相色谱仪系统，美国Waters公司；微量进样器
4、，瑞士HAMILTON公司；CX-250超声波清洗器，北京医疗设备二厂；μBondapakTMC18柱，300mm×3.9mm,美国Water公司。虫草素，瑞士Fluka公司。蛹虫草菌(CordycepsmilitarisL.Link)，采自沈阳辉山风景区。2方法与结果2.1固体培养方法将采集到的蛹虫草菌进行分离纯化，将-级种子液接入固体培养基中，接种量为每瓶5ml,25°C暗培养，在固体培养过程中，从一级种子接入固体培养基后第2天开始每隔3天观察其菌丝、子座的生长情况，记录其菌皮覆盖培养基以及菌皮开始转黄的情况，发现一些培养
5、瓶中白色菌皮并未转黄，将其编号为A;将长有子座的瓶中的黄色菌皮编号为B。2.2色谱条件流动相：PH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇(85:15);流速：lml/min;检测波长：260nm；灵敏度：1AUFS；柱温：室温；进样量：10μl。2.3标准曲线的制备精密称取虫草素、腺苷、尿苷对照品适量，用50%乙醇溶解，定容至5ml。分别取各对照液0.02、0.06、0.12、0.30、0.40、0.50ml至5ml量瓶中，加50%乙醇至刻度，进样测定。对照品峰面积A与各对照溶液的质量浓度C(μg/ml)之间成良好的线性关系。线性范围和回归方程如
6、下：虫草素A=39.58C-0.0342线性范围4.03-100.8μg/mlr=0.9996。2.4供试液制备用镊子将编号为A、B、C的三种菌皮分别钳出，置于40°C烘箱中烘干，研成粉末。分别称取lOOmg，置具塞试管中，精密加水10ml，超声提取30min，2次，将提取液以5000r/min离心lOmin,上清液用0.45μm的微孔波膜过滤，用于HPLC测定。2.5精密度试验取混合对照品溶液连续进样5次，每次10μl,按色谱条件测定色谱峰面积，结果虫草素RSD为2.06%。2.6重复性试验取供试品C，分别精密称取5份，每份
7、O.lg，按样品液制备方法制备供试溶液，测定含量，虫草素的RSD为1.98%。2.7供试溶液稳定性试验本实验考察了蛹虫草三种培养物的提取液在避光4°C条件下分别于0、4、8、12、24、36、48、60h进样测定，结果显示48h内供试品含量稳定。2.8供试品测定取2.4项下的供试品液，进样10μl,重复5次，取平均值。样品A、B中的虫草素含量分别为85.16mg/g和5.05mg/g,色谱图见图1。图1样品HPLC色谱图（保留时间分别为9.18,9.27和9.24分钟的色谱峰为虫草素）A供试品A,B供试品B,C虫草素标准品2.9冋收率实验
8、称取已测知含量的样品3份各100mg,分别按含量的50%、100%、120%加入对照品贮备液，依2.4项下提取测定，计算加样冋收率，结果见表1。3讨论
