基因工程药学整理重点复习提纲

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1、第一章基W工程：在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基W通过在体外重组异入受体细胞内，使这个基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的过程。基W工程药学：应用基因丄程技术，研制和开发核酸、多肽和蛋白质药物的理论、方法和应用的一门学问。基因工程药物的特征：第一，基因工程药物来源的过程应当足外源核酸分子在不同种寄主细胞中进行繁贿，能够跨越天然物种屏障，把来ft任何一种生物的®因放置在新的生物细胞屮,而这种生物与原生物毫无亲缘关系。第二，所表达基因工程药物的DNA小R段在新的寄主细胞屮进行扩增，实现很少暈的DNA样品拷贝出人暈的口门以分子，而

2、且是人量的没奋任何-K他DNA序列污染的，绝对纯浄的DNA分了•群体，再由这些DNA分子群体经转录、翻译、翻译后蛋白质折叠、修饰蛣后成为具冇生物活性的难因工程药物。基因工程药学的主要研究内容.•一，用基因工程技术制备体内缺乏的多肽或蛋白质，来替代或补充体A对这类活性多肽或蛋A质的需求。二，研究蛋A质的生物学活性。三，研究菽因工程药物的临床应川。基因工程技水方法：1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、阳性兑隆的筛选鉴定5、表达蛋白的生产和纯化6、理化、生物活性和毐性的一系列检测。第二章基W兑隆主耍包拈：1、迕接外

3、源基因和兑隆载体，构建重组DNA分子2、将重组DNA分子导入受体细胞，使外源基因随受体细胞的分裂而复制、扩增。限制restriction：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。修饰modification：细菌A身的DNA碱®被甲基化酶甲蕋化修饰所保护，不能被A身的限制性内切酶所识别切割。平末端bluntorflushend：有些限制性核酸内切酶能够在识別序列中间的M—个位置进行将DNA双链切断，产生的DNA末端为平末端。产生的平末端DNA可以任意连接，但连接效率低。黏性末端stickyend:大多数的限制性核酸内切酶在两条链错

4、开2〜4个核苷酸处切断，这样产生的DNA末端带冇5'突出或者3'突出的DNA单链，这样的末端称为黏性末端。连接效率高，从3'末端切割的产生的足3'黏性末端，5'末端切割的产生的是5'黏性末端。位点偏爱sitepreference：存些限制性内切酶对冋一底物的不同位点表现出偏爱切割的特性，即对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率。这种现象就叫做位点偏爱。熟悉：酶切反应条件1、缓冲液：缓冲剂，Mg2+,DTT（二硫苏糖醇），BSA（小牛血清白蛋白）分为三组低盐组（0~50mmol/L）、中盐组（50〜lOOmmol八）、高盐组（100~1

5、50mmol/L）2、限制性内切酶的反应温度一般为37°C（Taq为65°C,ApoI为50°C）3、反应时间：通常为一个小时或者更多，酶延长反应时间，可减少酶的用量4、终止酶切反;、V:的方法：EDTA螯合镁离子（lOmmol八）、加热（65°（3或80°（：处理200^）、苯酚抽提去除蛋白和试剂盒纯化DNA（用于耐高温的）虽兮洒性staractivity:指在非最适的反应条件卜*，沒控酶的识别特异性会降低，表现出松弛的专一性避免的星号活性方式：1、较少的廿油浓度2、保证反应体系内无冇机溶剂3、减少酶的用fi，防止过度酶切4、控制酶切反应

6、的pH5、适当提高缓冲液离子强度。甲基化酶用于保护宿主的DNA不被相疢的限制酶所切割。DNA聚合酶的共同特点:都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加入双链DNA分子引物链的3'-0H末端；催化核苷酸的聚合作用，而不发生从A物模板链上解离的情况。DNA聚合酶I有三种不同的酶催活性：①5'43'的聚合酶活性。②5'43'的核酸外切酶活性。③3'W的核酸外切酶活性。熟悉：DNA聚合酶I可以被分割成两个片段①;H有完伞的的核酸外切酶活性。②；n有完全的的聚合酶活性和3'45'的核酸外切酶活性。KlenowDNA聚合酶：M■奋DNA聚合酶I的543'的聚合酶

7、活性和345'的核酸外切酶活性。用途：1、修补经限制性核酸内切酶产生的3'隐蔽末端。2、标记DNA片段的末端。3、合成cDNA克隆中cDNA的第二条链。4、DNA序列测定。5、DNA定点突变。T7DNA聚合酶的优点：1、持续合成能力强，一旦与模板链结合就会不间断的合成互补链2、3'W外切酶活性强，单链和双链都能水解3、不受DNA二级结构的影响，其他合成酶受DNA二级结构的影响。第三章基因组文库和cDNA文库的异同两者获取核酸的來源不同，基因组文库來源于染色体DNA,cDNA文库足从细胞屮分离总RNA和mRNA，然f•以mRNA为模板反转录合

8、成cDNA，与载体相连，转化怙主细胞而成。两者建库的技术路线不同，产生的寐因结构不同，应用也不同。如果研究的鬥标足要弄淸楚一种蛋白质的氨基酸序列，则可以根据克隆的cDNA分子的核