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1、1.基因工程概念：基因工程是一门以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代技术方法为手段的新兴交叉学科，它诞生于1973年，其发展十分迅速，新知识、新概念、新技术不断涌现，并广泛渗透到生命科学的各个领域，带动了整个生命科学的发展，是现代生物技术小的核心技术。它为人类创造新生物开辟了新天地。2.基因工程的定义：基因工程是将不同来源的基因（DNA分子），按照工程学的方法进行设计，在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。基因工程乂称DNA重组技术。3.基因工程的特点及实施条件：基因工程的最大特点是分子水平上的操
2、作，细胞水平上的表达。其实施包括四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。4.基因工程的基本步骤：（1）分离制取带有目的基因的DNA片段；（2）DNA片段和载体DNA在体外连接；（3）将重组DNA分子导入合适的受体细胞，并扩增繁殖；（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的重组体克隆；（5）外源基因的表达和产物的分离纯化。5.DNA复制的特点：（1）DNA的复制是从特定的复制起始点开始并按5V的方向进行；（2）DNA分子的半保留复制；（3）DNA分子的半不连续攵制；（4）DNA分子复制是通过DNA聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子的协同有序的
3、工作完成的；（5）DNA分子复制具有高度的精确性和准确性。6.DNA的变性、复性与杂交：在高温、强碱及某些试剂存在的条件下，双链DNA分子氢键断裂,两条链完全分离，形成单链DNA分子，这种情况称为DNA变性。DNA的复性是指变性DNA在适当的条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现彖，它是变性的逆转过程。热变性DNA—般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。杂交的基本原理是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。7.工具酶：基因工程涉及的工具酶一般分为三大类：即限制性内切酶、连接酶和
4、修饰酶。&限制性内切酶是一类能够识别和切割双链DNA分子小某种特定核背酸序列的酶。它所识别的由4-8个核背酸组成的特定的核背酸序列，称为核酸内切限制酶的识别序列。识别序列大多呈冋文结构，即有对称轴，且两条链的5,-3,方向的序列组成相同。限制性内切酶就是在双链DNA分子的识别序列内切割磷酸二脂键，切割后形成粘性末端或平末端的DNA片段。限制酶命名要点：属名+种名+株名。即第一个字母釆用细菌属名的第一个大写字母，第二、三两个字母采用细菌种名的前两个字母，第四个字母表示菌株类型，如杲一个菌株屮有儿种限制酶，则在株名后用罗马数字表示。b.原核生物主要有二种类型的D
5、NA连接酶：E.coliW连接酶和T4DNA连接酶。基因工程中最常用的是T4DNA连接酶。这两种酶有二个重要差异：第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同，T4DNA连接酶用ATP,而E.coliDNA连接酶则用NAD。第二是在正常情况下只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的DNA片段，E.coliDNA连接酶则不能。c.DNA聚合酶的作用是催化DNA的体外合成反应，它能够把脱氧核糖核昔酸连续地加到双链DNA分子引物链的3,-0H末端，合成出与模板序列互补的产物。其屮：DNA聚合酶I最主要的用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DN
6、A探针。Klenow酶是由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶水解之后，产生的分子量为76kDa的大片段分子。Klenow酶仍具有5,-3,的聚合酶活性和3,-5,的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5,-3，的核酸外切酶活性。T4DNA聚合酶具有5,-3，的聚合酶活性和3,-5，的核酸外切酶活性。也可用来标记DNA平末端或隐蔽的3•-末端,在没有dNTPS存在的条件下,3-外切酶活性比Klenow酶强200倍，可以给平末端的DNA片段或具有3--隐含末端和3--突出末端的DNA片段作末端标记。T7DNA聚合酶及修饰的T7DNA聚合酶具有5--3-的聚合酶
7、活性和3--5-的核酸外切酶活性，是所有已知DNA聚合酶屮持续合成能力最强的一个，并具有很高的单链及双链的3--5-核酸外切酶活性。主要用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应。Taq酶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA为模板，按5,-3,的方向合成新生的互补链DNA。这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，而II在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力，目前广泛用于聚合酶链式反应(PCR,polymerasechainreaction)及DNA测序。末端转移酶系从小牛胸腺中纯化出来的一种碱性蛋白质。它能够催化脫氧核莒三磷酸逐个地加到DNA分子的3--0
8、H末端，反应中不需要模板的存在，4种dNTPS小的任
