微生物大实验土壤中微生物的分离鉴定

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1、土壤中微生物的分离与研究一、实验目的1.学习微生物纯系分离、培养方法。2.掌握划线分离纯化微生物的方法。3.掌握微牛.物牛理生化反应的研究方法。4.了解该菌种的生物学特征。二、实验原理土壤足微生物的良好先境，土壤屮奋多种类群的微生物，它们对£1然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护柯着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特別密切，不同的土壤和梢物对根际微生物产生敁著影响，而不同的根际微生物由于艽生理活性和代谢产物的不M,也将对上壤肥力和梢物营养产生积极或消极的作用。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一

2、般地说，在土壤表面，由于円光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm〜30cm的土层中菌数最多，随土层加深，荫数减少。土壤中微生物以细齒数S蛣多，为儿百万个/克土至儿亿个/兑土，冇各种生理类群，营养类型多属异养型，鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含景为几万个/克十至几百万个/克土，但其生物量不比细菌低，因为菌丝体积较大。土壤中真菌含量为儿千个/克土至儿十万个/克土，而其生物量常比细菌的大。通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备川。涂布分离细茼的平板，温箱培养Id〜2d后，然后挑取各中尚

3、落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。然后根据怕杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。三、实验材料1.培养基：牛肉咅蛋G胨培养基、PDA培养基、固体汕脂培养基、固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养®、蛋白胨水培养®、葡萄糖蛋白胨水培养基。2.染液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、1%结晶紫水溶液、20%硫酸铜水溶液、95%乙醇、卢戈氏碘液、甲基红指示剂、乙醚、吲哚试剂等等。3.仪器和其他用品：无荫平板、接种

4、环、试管、刮刀、载玻片、盖玻片、洒精灯、显微镜、双层瓶装香柏油和二甲苯)、擦镜纸、接种环、镊子、载玻片夹、试管架、滤纸、锥形瓶、电炉。四、实验步骤1.分离纯化(1)取样从生物北楼北侧小田地里选择土壤较肥沃的地方取得土壤，称SlOg放入锥形瓶中，加入90ml水,静置30min。(2)稀释将上壤样品10g加入90ml灭菌水中振荡30min,形成土壤悬浊液，取1ml加入装有9ml火菌水试管屮振荡形成10“稀释，依次将土壤样品稀释10_210'1()1()_5。(3)涂布将o、iodI(y210'10_4、i(r5的稀释样品分別涂布到己制好的固体培养蕪平板上

5、，每种涂3个平板。(4)培养将平板置于37C恒温培养三天。(1)分离从T•板中挑取单个菌落按照下图进行T•板划线分离培养，培养1天，共选了6种菌，1个士;歯。(2)纯化将划线长出的苘接种于己准备好的固体斜面培养基屮，培养1天。(3)镜检对平板中的6种歯分别进行美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观察，并记录结果。(4)保种将长!I!菌的斜而放入冰箱中保存。1.霉菌的鉴定配置PNA土豆培养葙，分离纯化后，进行小室培养，然后在显微镜下进行观察，记录形态。2.生理生化鉴定分别配置凼体油脂培养基、固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨

6、水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基，进行汕脂、淀粉分解鉴定，葡萄糖、乳糖发酵鉴定,以及平基红、吲哚鉴定。3.查伯杰手册根据菌落形态、染色性质及生理生化性质查分离岀的菌为哪几种菌。五、实验结果及分析1.细菌实验结果记录菌种1菌种2菌种3菌种4菌种5菌种6菌落描述大小mm0.31.22.1成片0.2较大形态圆形圆形圆形不规则圆形不规则边缘整齐整齐不整齐不整齐整齐不整齐表而有隆起有隆起有细小颗粒状突起光滑褶皱聚于一点形成突起.Si白色光滑干湿干干干有粘性干湿颜色乳黄色乳白色內色略显透明內色略显透明底部乳白色透明略显青色芽孢有，椭圆形，位于菌体中部，不有有无无无膨

7、大菌体形态短杆状椭球形成链，纺锤状球状成链单个球体长杆状短杆状革兰氏染色阳性阴性阴性阳性阳性阴性运动性明显不运动明显不运动明显明显淀粉水解是是是是是否油脂水解否否是否是否葡产酸是是是否是否荀产气糖否否否否是否乳产酸否否否否足否糖产气否否否否是否甲基红红黄红黄红属芽孢杆苘属不确定梭苘属消化球茼属根瘤菌属硝化杆菌属2•细菌计数平板编号123稀释倍数10'5每个平板菌落数283234lg土壤屮菌种平均数1.41X108lg上壤屮菌种数=每平板菌种数X稀释倍数X1/収样体积数X9例如：lg土壤中菌种1的数量=32X105X1/0.2X9=1.44X1083.霉

8、菌形态菌丝顶端形状假根足细胞匍匍菌丝确定类型培养的霉菌有横隔扫帚状无无无青霉1.照片（1）革兰