vibrio spqy101胞外多糖的分离纯化及抗细菌生物被膜活性研究

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1、中国海洋大学博士论文IlYllllY1llll928tlllllllll928lllltlllllllltlllltlllll4719帅Vibriosp．QYIOI胞外多糖的分离纯化及抗细菌生物被膜活性研究指导教师签字：监学位论文完成日期：答辩委员会成员签字：价撇‘^鼍／∥7I叉9’／至者一躺’倒耀p、：多砌／、．‘，二‘l中国海洋大学博士论文独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含

2、未获得!逵；垫逡查基丝益塞挂型庄塑的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：墓M易签字日期：砂。，年f月仿日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“

3、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：善鹇翮签字：j肋签字日期：沙·f年j月西日签字日期：如l，年，月玎日’-。＼中0中国海洋大学博士论文Vibriosp．QYl01胞外多糖的分离纯化及抗细菌生物被膜活性研究摘要细菌生物被膜是由细菌及其分泌的胞外基质所形成的多细胞结构，它是抗生素渗透和作用的物理屏障。一直以来，细菌胞外多糖被认为是生物被膜形成的重要因子，不但

4、起始细菌的粘附，而且在生物被膜复杂结构的形成中也发挥重要的作用。然而，近期研究却发现少数几种细菌的胞外多糖(例如EcoliII型荚膜多糖)不但不参与生物被膜的形成，而且能抑制其自身甚至其它细菌的生物被膜形成。本实验室在前期工作中发现Vibriosp．QYl01发酵液粗提物具有广谱的生物被膜抑制活性，进一步证明此活性与多糖类物质有关。本文旨在对QYl01所分泌的抗细菌生物被膜活性多糖进行分离纯化，分析其性质、组成，并深入研究抗细菌生物被膜活性及作用机制。实验首先采用离子交换色谱和凝胶排阻色谱相结合对OYlOl发酵液中的多糖进

5、行分离纯化，得到具有抗细菌生物被膜活性的多糖A101。采用现代仪器分析手段，包括IR、HPSEC、HPLC等，对A101的结构特征、化学组成及分子量进行分析。结果表明A101分子量高达546kDa，其单糖组成较复杂，但是以糖醛酸为主、其次为鼠李糖和氨基葡萄糖，其他单糖含量很低。将A101与已知弧菌胞外多糖进行比较，结果显示A101与具有生物被膜抑制活性的Vibriovulnffi伽M06．24I型荚膜多糖相似，都是以糖醛酸为主、带负电荷的胞外多糖。进一步基因克隆和生物信息学分析表明菌株Vibriosp．QYl01中的确存在

6、I型荚膜多糖转运蛋白(Wza)，根据以上结果我们推钡]]A101可能是QYl01的I型荚膜多糖。细菌生物被膜形成能力评价体系包括静态模型和动态模型，为了能对生物被膜进行实时观察，首先构建了金黄色葡萄球菌的绿色荧光蛋白表达株RN6390一GFP，荧光倒置显微镜及激光共聚焦结果显示，Flowcell中的RN6390生物被膜在24h达到成熟，而且在以后较长时间内处于动态平衡的稳定状态。在静态模型条件下，A101对铜绿假单胞菌FRDl和金黄色葡萄球菌RN6390生物被膜的形成都具有明显的抑制作用，而且这种抑制作用具有浓度依赖性。当

7、A101的浓度达到100ug／mL时，其对铜绿假单胞茵FRDl生物被膜的抑制率达中国海洋大学博士论文75％，对金黄色葡萄球菌RN6390的抑制率超过90％。进一步研究显示，A101的抗生物被膜活性具有普遍性，在测试菌株中，80％(12／15)的革兰氏阴性菌和70％(7／10)的革兰氏阳性菌的生物被膜形成均可以被有效抑制，其中有效率超过50％的达48％(12／25)。在动态的Flowcell模型中，A101的生物被膜抑制活性更为明显，100ug／mL的A101对铜绿假单胞菌FRDl生物被膜抑制率达95％以上，而对金黄色葡萄球

8、菌RN6390的抑制率甚至超过99％。实验中还利用Flowcell模型检测了A101对菌体成熟生物被膜的清除作用，结果显示，100ug／mLAl01作用12h对铜绿假单胞菌FRDl成熟生物被膜的清除率即可达85％以上，然而A101对成熟的金黄色葡萄球菌RN6390生物被膜没有清除作用。我们对A101作用