曲霉菌胞壁及胞外多糖的分离和纯化

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1、分类号：R394.3学校代码：10392学科专业代码：100208学号：200901364福建医科大学硕士研究生毕业论文曲霉菌胞壁及胞外多糖的分离和纯化TheExtractionandPurificationoftheCellWallandExtracellularPolysaccharidesofAspergillus学位类型：医学硕士所在学院：福总临床医学院研究生：黄尔学科、专业：临床检验诊断学导师：兰小鹏教授研究起止日期：2011年5月至2012年5月答辩日期：2012年5月30日二零一二年五月0万方数据0万方数据福建医科大学硕士学位论文目录英文缩略词表…

2、……………………………………………………………………1中文摘要……………………………………………………………………………2英文摘要……………………………………………………………………………4一、引言……………………………………………………………………………6二、材料和方法……………………………………………………………………10三、结果……………………………………………………………………………22四、讨论……………………………………………………………………………30五、总结……………………………………………………………………………37参考文献……………………………

3、………………………………………………38综述…………………………………………………………………………………41致谢…………………………………………………………………………………521万方数据英文缩略词表（ABBREVIATIONS）缩写英文全称中文全称BCABicinchoninicacid二喹啉酸C/OCut-off临界值EPEpoxyepoxide环氧树脂EDTAethylenediaminotetraceticacid乙二胺四乙酸FDAFoodanddrugadministration美国食品与药物管理局GMgalactomannan半乳甘露聚糖Hhour

4、小时HighperformancegelpermeationHPGPC高效凝胶色谱法chromatographyIAInvasiveaspergillosis侵袭性曲霉病Mminute分钟ODopticaldensity光密度TrisTris（hydroxymethyl）aminomethane2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇TLCThinlayerchromatography薄层色谱法1万方数据福建医科大学硕士学位论文曲霉菌胞内及胞外多糖的分离纯化研究摘要【目的】半乳甘露聚糖(galactomannan,简称GM)存在于曲霉菌胞壁，且在曲霉菌生长过程中会释放

5、至外液。GM已作为诊断侵袭性曲霉菌感染的标志物，而现有的检测方法存在诸多局限性，本研究目的从烟曲霉菌中提取纯度高、分子量均一的GM，为进一步建立基于GM检测的侵袭性曲霉菌感染诊断新技术奠定基础。【方法】1.选取温度为A因素、通气量为B因素、接种量为C因素，各取3个水平，以菌体生成量和胞外多糖产量为指标进行正交实验，通过分析选取最优培养条件。2.收集烟曲霉发酵液，通过浓缩、醇沉、抽滤、透析、冻干等步骤得到粗多糖，再将粗多糖行去蛋白、过柱等纯化步骤处理，得到多糖P1；采用碱裂解菌丝体，经过离心、浓缩、透析、冻干等步骤得到粗多糖，经conAsepharose4B亲和层

6、析填料纯化，加入葡聚糖酶，得到多糖P2。3.采用TOSOHTSKgel3000PWxl柱子，分析多糖的纯度；高效凝胶色谱法测定标准品右旋糖酐分子量，并制成标准曲线，计算出待测多糖分子量。4.用三氟乙酸催化多糖水解成单糖，采用硅胶薄层层析法初步分析多糖的单糖组分；继而用三甲基硅咪唑和醋酸酐将单糖衍生化，使之成为易挥发、对热稳定的衍生物，采用气相色谱法进一步分析单糖的种类和比例。【结果】1.通过正交试验分析，培养温度28℃、通气量150ml，接种量为5%时，曲霉菌的生长状态最好，得到的胞外多糖量和菌丝体量分别为初始条件的1.151倍和1.273倍。2.经过一系列纯化

7、步骤，得到1.58g的胞外多糖P1，纯度达94.7%；162.7mg胞内多糖P2，纯度为96.0%；高效凝胶色谱法分析，胞外多糖分子量均一，分子量在21kd左右，而胞内多糖的分子量不均一。2万方数据福建医科大学硕士学位论文3.硅胶薄层色谱法初步分析，P1、P2多糖的单糖组分均为半乳糖和甘露糖。通过气相色谱分析，P1的半乳糖与甘露糖的比例为1:1.18。【结论】本实验成功地从烟曲霉菌的胞外发酵液中分离到纯度高、分子量均一的半乳甘露聚糖，分子量和单糖组成与文献报道一致，基本符合适配子筛选的要求，可以用于本科题组研制新的检测方法。而胞壁的多糖分子量不均一，结构较复杂，

8、有待于进一步深入研究。【