抑制nfκb诱导肝星状细胞凋亡

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1、目录中文摘要l英文摘要7英文缩写13论文题目抑制NF．rd3诱导肝星状细胞凋亡引言15第一部分靶向NF．rd3的小干扰RNA诱导肝星状细胞凋亡、分子机制及对ECM代谢的影响前言日U舌11／7材料与方法20结果33附图35附表39讨{念41小结45参考文献46第二部分双环醇对HSC—T6细胞凋亡、凋亡机制和ECM代谢的影响前言日IJ吾5252材料与方法53结果63附图64附表72讨论80小结83参考文献84第三部分双环醇对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用前言目Ij吾89材料与方法90结果多日：木9a。I．y附图9

2、7讨论103小结105参考文献106综述l09致谢128个人简历129中文摘要抑制NF—KB诱导肝星状细胞凋亡摘要肝纤维化的本质是肝脏细胞外间质纤维生成和降解失平衡的结果，而活化的肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)是细胞外基质的主要来源，HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心事件。HSC的活化是肝纤维化发生发展的关键环节，与静止及过渡期的HSCs比较，活化的HSCs能高水平表达I型胶原和基质金属蛋白酶抑制因子1，在肝纤维化形成过程中，HSC数量是增多的；而在肝纤维化的逆转过程中其数量是

3、减少的。当前，抗肝纤维化治疗主要策略是减少活化HSC总数量，而实现这一目的的主要途径有二个：一是将活化的HSCs逆转为静止的；二是促进活化HSCs凋亡，使其总体数量减少。由于HSC的活化是个不连续的多阶段过程，将活化的HSCs逆转几乎是不可能的，因此，减少HSC活化、增殖，促进HSCs凋亡，减少其数量，减少ECM，成为肝纤维化治疗的主要策略。HSCs不仅是肝脏炎症过程的靶细胞，更是炎症的效应细胞，这一观念的改变，代表着肝纤维化研究领域的最新进展。NF-KB(nuclearfactorkappaB)及其调控系统是介导

4、炎症反应的关键调节因子。在肝纤维化形成过程中，枯否氏细胞(Kupffercell，KC)可以被细胞变性、坏死释放的脂质过氧化物、细胞因子等炎性介质激活而分泌大量的细胞因子、趋化因子等促炎介质及活性氧等，这些物质可启动或加剧肝脏炎症反应。NF—KB作为炎症反应最为重要的转录因子，对KC分泌上述介质进行调控。肝损伤时由于肠道细菌和肠壁通透性增加，门脉系统和血液循环中的脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)水平增加，后者通过HSCTLR4受体活化NF—KB。活化的HSCs内NF—KB活性增强，导致炎性因子

5、表达增加，放大肝脏炎症损伤反应，促进了HSC的活化；与此同时，NF—KB在细胞凋亡中发挥重要作用，NF-KB能抑制多种类型的细胞凋亡。NF-KB活性增强可减少HSC凋亡，促进其活化、增殖及移动。因此，通过抑制NF-KB活性，对减少HSC活化，促进HSC凋亡，减少ECM，有重要作用，将有可能成为逆转肝纤维化新策略，并将产生重大影响。本研究通过小干扰RNA(shortinterferingRNA，siRNA)技术抑制HSCNF—KB基因及其对促进活化的HSC中文摘要凋亡，凋亡机制以及ECM代谢的影响，证明了抑制NF—K

6、B活性可促进活化HSC凋亡，减少ECM合成，加强其降解，从而有利于抗肝纤维化治疗；以此为启发点，进一步研究了双环醇对NF-KB活性的抑制作用，探讨了其对促进活化HSC凋亡作用的影响、作用机制及对活化HSCECM代谢的调“节作用，为双环醇用于抗肝纤维治疗提供了理论依据；本研究还探讨了双环醇对四氯化碳引起的急性肝损伤保护作用机制与NF—KB关系，证实双环醇可通过抑制NF-KB活性，减少氧应激，减少炎症因子的表达，保护肝细胞，，减少HSC活化，从而有利于肝纤维化的防治。第一部分：靶向NF．KB的小干扰RNA诱导肝星状细胞

7、凋亡作用、分子机制及对ECM代谢的影响目的：NF．KB通路在肝星状细胞凋亡调控中起重要作用，抑制NF．KB活性的药物可促进HSC凋亡，逆转实验性肝纤维化，本文应用小分子干扰RNA技术沉默NF．KBp65基因，观察其对HSC凋亡、凋亡机制和ECM的影响。‘。方法：选用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂，将针对NF．rBp65亚基的siRNA转染HSCs．T6细胞72h后，再与脂多糖LPS孵育1h，然后实时荧光定量PCR法检测转染细胞中NF．rd3p65、I型前胶原、TIMP．1、a．SMA、T

8、GF[31和抗凋亡蛋白A1mRNA表达，Westernblot检测NF．r,Bp65和Bcl．2蛋白表达，酶谱法检测MMP．2活性，流式细胞术、TUNEL及caspase．3活性检测细胞凋亡。结果：①NF—KBsiRNA转染对HSC-T6细胞NF-KB表达的影响：Westernblot分析显示，LPS作用于HSC—T6后，NF—KBp65蛋白表达量明显高于空