菲高效降解菌的驯化 分离 鉴定及其降解菲的特性与机理研究

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1、摘要摘要多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于环境中的有机污染物。大多数的多环芳烃具有“三致”作用，通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害，因而这类化合物引起了环境学家们的关注。如何利用微生物的降解作用将其从环境中去除已成为人们研究的热点问题。本论文以菲为多环芳烃生物降解研究的模型物，主要研究内容包括：(1)多环芳烃菲降解菌的驯化、筛选和分离；(2)降解菌株GY2B的鉴定、抗生素敏感性试验以及质粒的提取试验；(3)菲的降解特性

2、研究，以及温度、pH、外加营养物质和初始底物浓度等因素对菌株GY2B的生长和菲降解的影响；(4)菲降解菌的底物降解范围研究；和(5)菲生物降解中间产物的分析及其代谢途径的推导。选用水．硅油双相体系和单一水相体系两种方法来驯化多环芳烃降解菌。结果发现水．硅油双相体系筛选出的三种混合菌系：GY2、GS3和GM2对菲的降解效果要好于单一水相体系筛选出的菌。进一步研究确认这三种混合菌系在72h能分别降解99．9％、99．9％和91．9％的菲(初始浓度100mg／L)。通过平板涂布与划线，从混合菌GY2中分

3、离出一株菲高效降解茵GY2B，48h对菲的降解率达到99．1％。镜检表明菌株GY2B为革兰氏阴性无芽孢杆菌，16SrDNA序列分析表明其和鞘氨醇单胞菌的同源性最高，初步鉴定它为勋hingomonassp．GY2B，该菌株的GenBank登陆号是DQl39343。菌株GY2B对四种常用的抗生素：头孢呋辛、氯霉素、红霉素和四环素表现敏感，对羟氨苄青霉素中度敏感。且菌株GY2B没有明显的质粒DNA条带。菌株GY2B的最佳生长温度是25—30oC，最佳pH值范围是7．1～7．4，对菲的降解在pH值7～10

4、范围内都比较高。试验表明添加低浓度的蛋白胨或葡萄糖对细胞的生长和菲的降解都有一定促进作用，而葡萄糖的作用似乎更明显一些。但高浓度葡萄糖(≥500mg／L)的加入对细胞生长会产生毒害作用。当菌株GY2B以10、60和100mg／L初始浓度的菲为唯一碳源时，48h菲的降解率均在99％以上，而230mg／L初始浓度下菲的降解率只有70％左右，此后菲浓度基本不再减少，到120h仍有大量的菲残留，此时菌株GY2B的细胞也大量死亡。进一步研究证实了高初始浓度(250mg／L)的菲样品中积累了一种中间产物一一l

5、-羟基．2．萘酸，之后的研究表明高华南理工大学博士学位论文浓度的1．羟基．2．萘酸对菌体细胞有抑制作用。另外，通过计算菌株GY2B在不同菲初始浓度下的比生长速率p(对数生长期)发现底物菲的初始浓度和菌株的比生长速率肛之问没有显著的相关性．底物降解范围实验表明：菌株GY2B能够以一定浓度的萘、菲、1．羟基．2．萘酸、2．萘酚、水杨酸、邻苯二酚、苯酚、苯和甲苯为唯一碳源和能源进行生长和繁殖，但不能利用和降解低浓度的1．萘酚、邻苯二甲酸和对苯二酚为唯一碳源生长。同时，菌株GY2B在降解水杨酸、1．羟基．

6、2．萘酸和萘的过程中都有中间产物2-羟基粘康酸半醛，而降解邻苯二酚的过程有产物己二烯二酸。试验还发现菌株虽然不能利用1．萘酚为唯一碳源生长，且1．萘酚对细胞有抑制作用，但是当一定浓度的1．萘酚和一定浓度的菲共存时，菌株GY2B能利用和降解部分的1．萘酚。UV．Via分析发现混合菌GY2和菌株GY2B降解菲的产物中有羟基与芳香环相连的结构以及酚酮结构的化合物。另外还证明菌株GY2B降解菲的过程中有1．羟基．2．萘酸和2．羟基粘康酸半醛这两种中间产物的产生。GC．MS分析发现菌株GY2B代谢菲的时候有

7、中间产物水杨酸，1．萘酚和1．羟基．2．萘酸，以及微量的1．羟基．2．萘醛和1．羟基．2．萘酸甲酯。而混合菌GY2的代谢物中除没有水杨酸外，其余产物和菌株GY2B的一样。通过底物降解范围试验、UV．Vis和GC．MS分析，推导出菌株GY2B降解菲的途径如下：在菌株GY2B的作用下，菲先开环生成1．羟基．2．萘酸甲酯和1．羟基．2．萘醛，然后转化成1．羟基．2．萘酸，经脱羧成为l-萘酚，再开环后生成水杨酸，通过邻苯二酚间位途径裂解生成2．羟基粘康酸半醛，最后进入三羧酸循环(TCA)彻底降解为C02和

8、H20。关键词：多环芳烃；菲；生物降解；中间产物；代谢途径；16SrDNA；鞘氨醇单胞菌ⅡABSTRACTAbstractPolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)arewidespreadenvironmentalpollutants．PAHsareofgreatenvironmentalandhumanhealthconcernssincemanyPAHshavebeenshowntobetoxic，mutagenicandcarcinogenic