pgm测序方法-protocol

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1、314芯片测序方法文库构建：PCR扩增基因组DNA的目标区域1.选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。对每一个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR管内。以下表格提供了包含和未包含IonAmpliSeq™SampleIDPanel的反应体系。对多个反应可准备配置混合溶液。2X引物池(Cat.nos.4477685,4477686,andcustompanels)成分不包含IDpanel（ul）包含IDpanel（ul）5XIonAmpliSeq™HiFiMix442XIonAmpliSeq™PrimerPool1010可选:20XIonAmpl

2、iSeq™SampleIDPanel--1gDNA,10ngYYNuclease-freeWater6-Y5-Y总体积20205X引物池(Cat.nos.4471262and4475346)成分不包含IDpanel（ul）包含IDpanel（ul）5XIonAmpliSeq™HiFiMix445XIonAmpliSeq™PrimerPool44可选:20XIonAmpliSeq™SampleIDPanel--1gDNA,10ngYYNuclease-freeWater12-Y11-Y总体积20202.充分震荡，简单离心。3.将PCR管置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上

3、目标区域。阶段步骤温度时间持续酶活化99℃2分钟循环数（根据下表格设置）变性99℃15秒退火/延伸60℃4/8/16*分钟持续--10℃持续+*4分钟是对≤1536对引物池；8分钟是对1537-6144对引物池；16分钟是对6145-24576对引物池。+PCR产物可置于10℃过夜储存。引物对数目循环数标准DNA石蜡包埋DNA12-24212425-48202349-96192297-1921821193-3841720385-7681619769-153615181537-307214173073-614413166145-12288121512289-245761114注

4、意：Ready‐to‐usepanels:当加入IonAmpliSeq™SampleIDpanel时不需要调整循环数。Customprimerpools：如果一个custom设计的panel中包含两个引物池，并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。一般标准样品可以增加一个循环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个循环。如果引物池有两管及以上，应当分别扩增（10μl体系）。扩增完后混合取20μl进行下轮实验。暂停点–PCR产物可以储存在10°C过夜，需要更长时间储存，可以置于–20°C.部分消化引物序列1.轻度离心PCR管将反应后溶液收集到

5、管底。往每个混合反应液中加入2微升FuPa Reagent ，总体系达到22微升。2.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）3.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间50℃10分钟55℃10分钟60℃20分钟10℃持续（最长至1小时）将接头连接至扩增产物并纯化配置并运行连接反应1.如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。2.小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch溶液和接头。成分体积(μL)SwitchSolution4稀释的bar

6、code接头混合物2总体积281.在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。4.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）5.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间22℃30分钟72℃10分钟10℃持续（最长至1小时）暂停点–产物可以置于–20°C保存。纯化未扩增的文库使用Agencourt®AMPure®XP试剂1.5x样本体积重要事项!–将AMPure® XP reagent 置于室温并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。对每个样品，混合230微升无水乙醇和100微升

7、无核酶水。1.将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（1.5x样本体积）的Agencourt®AMPure®XP试剂。用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。2.将混合液置于室温5分钟。3.将1.5ml离心管置于DynaMag™‐96 Side Magnet (Cat. no. 12331D)磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。4.向离心管中加入150μL新鲜配制的70%乙醇，在磁力上来回移动1.5ml离心管来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动